光片熒光顯微術(shù)（LSFM）憑借高速三維成像和低光損傷特性，成為多細(xì)胞系統(tǒng)四維生物學(xué)成像的重要工具，但其光片厚度通常大于1微米，難以解析活細(xì)胞內(nèi)亞微米級(jí)精細(xì)結(jié)構(gòu)。本文聚焦瑞典皇家理工學(xué)院研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)的多片層可逆飽和光學(xué)熒光躍遷顯微術(shù)（Multi-sheet RESOLFT），該技術(shù)通過可逆光開關(guān)熒光蛋白（RSFPs）與周期性光開關(guān)圖案的結(jié)合，首次實(shí)現(xiàn)了亞100納米級(jí)光片厚度的超分辨斷層成像，并以1–2Hz的高速完成三維體積采集，為動(dòng)態(tài)追蹤細(xì)胞分裂、肌動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)及病毒樣顆粒行為提供了全新視角。

重要發(fā)現(xiàn)者為Andreas Bodén、Ilaria TESTA等，研究成果以《Super-sectioning with multi-sheet reversible saturable optical fluorescence transitions (RESOLFT) microscopy》為題，發(fā)表在《Nature Methods》雜志。

重要發(fā)現(xiàn)
01傳統(tǒng)光片成像的瓶頸與突破思路
傳統(tǒng)光片顯微術(shù)（如斜平面顯微鏡OPM）受光的衍射特性限制，即使采用高數(shù)值孔徑物鏡（NA~1.3），光片厚度也難以突破1–2微米，導(dǎo)致相鄰亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（如間隔<1微米的細(xì)胞膜）在成像中嚴(yán)重模糊。為解決這一問題，研究團(tuán)隊(duì)引入可逆飽和光學(xué)熒光躍遷（RESOLFT）原理，利用RSFPs的“開-關(guān)”雙穩(wěn)態(tài)特性——通過405nm寬場(chǎng)光將所有熒光蛋白激活為“開”狀態(tài)，再以488nm正弦干涉圖案光（周期1.2微米，傾斜35°）精準(zhǔn)關(guān)閉大部分區(qū)域的熒光，僅保留納米級(jí)厚度的發(fā)光片層。

02多片層并行化成像的核心機(jī)制
多片層RESOLFT的關(guān)鍵在于“光片印記-快速讀取”的創(chuàng)新流程：
光片印記：通過調(diào)節(jié)“關(guān)閉光”的功率和持續(xù)時(shí)間，可將發(fā)光片層厚度壓縮至100–200納米，較傳統(tǒng)OPM光片薄10倍以上（圖1b）。
快速讀取：使用488nm光片逐片激發(fā)印記的發(fā)光層，通過匹配光片間距與讀取光的艾里斑零強(qiáng)度點(diǎn)，避免相鄰層串?dāng)_。單次體積成像僅需10–20次熒光開關(guān)循環(huán)，顯著降低光漂白風(fēng)險(xiǎn)。

此外，該技術(shù)成功記錄了HeLa細(xì)胞4小時(shí)內(nèi)的分裂全過程（圖5），以及病毒樣顆粒在細(xì)胞膜表面的動(dòng)態(tài)聚集（圖6），展現(xiàn)了其在動(dòng)態(tài)生物學(xué)研究中的強(qiáng)大潛力。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
01突破衍射極限的“納米級(jí)光片”
傳統(tǒng)光片成像的分辨率由光片厚度和檢測(cè)系統(tǒng)共同決定，而多片層RESOLFT通過光學(xué)調(diào)控?zé)晒獾鞍组_關(guān)狀態(tài)，繞過了光的物理衍射限制。實(shí)驗(yàn)顯示，其有效光片厚度可穩(wěn)定控制在100–200納米，使三維體積分辨率達(dá)到250納米以下（x/y/z軸），首次在光片技術(shù)中實(shí)現(xiàn)了“超分辨斷層”能力。

03兼容性與多功能拓展
該技術(shù)對(duì)RSFPs的開關(guān)循環(huán)次數(shù)要求極低，可兼容rsEGFP2、rsEGFP(N205S)等多種熒光蛋白，并支持多色成像拓展。此外，其光學(xué)系統(tǒng)基于商用組件構(gòu)建（僅衍射光柵需定制），兼容標(biāo)準(zhǔn)蓋玻片，為高通量活細(xì)胞成像奠定了基礎(chǔ)。

總結(jié)與展望
多片層RESOLFT顯微術(shù)通過光片技術(shù)與超分辨原理的跨維度融合，突破了傳統(tǒng)光學(xué)成像在分辨率、速度與光損傷之間的固有矛盾，為解析亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的時(shí)空動(dòng)態(tài)提供了革命性工具。當(dāng)前技術(shù)已實(shí)現(xiàn)140×84×15微米3體積的高速成像，未來通過升級(jí)激光器功率和相機(jī)靈敏度，有望將采集速度提升至0.5秒/體積以下，并進(jìn)一步拓展至更大樣本（如類器官）和更深組織（需結(jié)合像差校正技術(shù)）。

在應(yīng)用層面，該技術(shù)可廣泛用于腫瘤細(xì)胞遷移機(jī)制、病毒組裝路徑、細(xì)胞器互作網(wǎng)絡(luò)等前沿領(lǐng)域，甚至為實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)藥物對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)影響提供可能。隨著RSFPs光譜多樣性的提升和自動(dòng)化算法的優(yōu)化，多片層RESOLFT或?qū)⑼苿?dòng)光片成像從“宏觀觀察”邁向“納米級(jí)動(dòng)態(tài)解析”，成為連接分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)的關(guān)鍵橋梁。

正如研究團(tuán)隊(duì)在討論中指出，這項(xiàng)技術(shù)不僅是光學(xué)成像的一次技術(shù)突破，更預(yù)示著“智能光片”時(shí)代的到來——通過動(dòng)態(tài)調(diào)控光開關(guān)圖案與熒光蛋白行為，未來的光片顯微鏡或?qū)?shí)現(xiàn)分辨率、速度與成像深度的按需切換，為生命科學(xué)研究帶來無限想象空間。

DOI:10.1038/s41592-024-02196-8.