文獻解讀：揭示NSUN2介導m5C甲基化在白血病中的關鍵調控作用_abio生物試劑品牌網
近日，浙江大學醫學院附屬第一醫院血液科葉文樂博士為第一作者，金潔教授、孫杰研究員為共同通訊作者，在腫瘤學領域國際頂刊《Molecular Cancer》發表題為《NSUN2-mediated cytosine-5 methylation of FSP1 protects acute myeloid leukemia cells from ferroptosis》的研究論文，研究揭示了NSUN2（NOP2/Sun RNA methyltransferase 2）介導的RNA胞嘧啶-5甲基化（m5C）修飾在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）中的重要作用。研究發現，NSUN2在AML患者樣本中異常高表達，并與不良預后相關。NSUN2通過催化FSP1（ferroptosis suppressor protein 1）mRNA 3’UTR的m5C修飾，促進其被YBX1（Y-box binding protein 1）識別和穩定，從而維持FSP1蛋白水平，保護AML細胞免受鐵死亡（ferroptosis）。此外，NSUN2抑制劑MY-1B和FSP1抑制劑iFSP1展現出抗白血病活性，并與鐵死亡誘導劑及標準AML治療藥物產生協同作用，為AML治療提供了新的潛在靶點和聯合治療策略。
標題：NSUN2-mediated cytosine-5 methylation of FSP1 protects acute myeloid leukemia cells from ferroptosis（NSUN2介導FSP1 m5C甲基化保護急性髓系白血病細胞免受鐵死亡） 發表時間：2025年7月21日
發表期刊：Molecular Cancer
影響因子：IF33.9/Q1
技術平臺：RNA-Bis-seq（RNA-BS）、RNA-seq等
作者單位：浙江大學醫學院附屬第一醫院血液科金潔、孫杰、葉文樂等
DOI：10.1186/s12943-025-02394-8
RNA m5C是一種普遍存在的表觀轉錄組修飾，對基因表達和細胞穩態起著關鍵調控作用。盡管其在實體瘤中的作用逐漸被認識，但m5C在急性髓系白血病（AML）中的功能圖譜仍然未知。本研究通過RNA-Bis-seq等實驗揭示NSUN2（主要的RNA m5C甲基轉移酶）是AML進展的關鍵調控因子。NSUN2在AML患者樣本中異常高表達，并與不良預后相關。功能研究表明，NSUN2促進白血病細胞增殖，在異種移植模型中增強腫瘤生長，并賦予細胞對鐵死亡的抵抗力。從機制上講，NSUN2催化FSP1 mRNA 3’UTR的m5C修飾沉積，促進其被m5C reader蛋白YBX1識別和穩定。這一NSUN2-YBX1-FSP1軸通過抑制脂質過氧化和氧化損傷，保護AML細胞免受鐵死亡應激。NSUN2或FSP1缺失誘導線粒體重塑，使細胞易于發生鐵死亡。野生型NSUN2或FSP1重構建挽救鐵死亡抗性，而催化失活的NSUN2（C271A/C321A）或功能缺失的FSP1突變體（G2A/E156A）未能轉換這一表型。通過NSUN2抑制劑MY-1B或FSP1抑制劑iFSP1進行藥理學抑制表現出強大的抗白血病效應，并與鐵死亡誘導劑、標準化療和BCL-2抑制劑維奈托克（venetoclax）產生強大的協同作用。本研究揭示了NSUN2和FSP1作為AML的預后生物標志物和治療靶點。強調了將RNA甲基化與鐵死亡逃避聯系起來這一新的表觀轉錄組機制，為克服AML治療耐藥性提供了一種雙重策略方法。
易小結
本研究通過易基因提供的RNA-Bis-seq技術服務揭示了NSUN2介導的RNA m5C修飾在急性髓系白血病（AML）中的關鍵作用，特別是其通過調控FSP1表達影響AML細胞鐵死亡的新機制。
RNA-Bis-seq技術作為研究RNA修飾的強大工具，不僅揭示了NSUN2在AML中的功能機制，還為理解RNA修飾在疾病中的作用提供了新視角。該技術不僅適用于AML研究，還可廣泛應用于其他疾病的表觀轉錄組學研究，為探索基因表達調控和疾病機制提供了有力支持。
研究方法
患者樣本收集：收集303例AML患者的骨髓和外周血樣本，用于分析NSUN2和FSP1的表達水平及其與預后的關系。
細胞培養與處理：使用多種AML細胞系（如MOLM-13、THP-1等）進行實驗，包括基因敲除、過表達和藥物處理等。
RNA-Bis-seq+RNA-seq：分析NSUN2缺失對AML細胞中RNA m5C修飾的影響，鑒定NSUN2介導的m5C修飾位點；對RNA-Bis-seq和轉錄組數據關聯分析，篩選與NSUN2介導的m5C修飾相關的差異表達基因。
基因編輯技術：通過CRISPR-Cas9基因編輯技術構建NSUN2基因敲除細胞模型，以及通過慢病毒介導的過表達系統構建NSUN2和FSP1過表達細胞模型。
細胞功能實驗：包括細胞增殖實驗、克隆形成實驗、流式細胞術分析細胞周期和鐵死亡水平等，評估NSUN2和FSP1對AML細胞功能的影響。
動物模型實驗：構建NSUN2基因敲除或FSP1基因敲除的AML小鼠模型，觀察其對AML進展的影響。
藥物聯合實驗：分析NSUN2抑制劑MY-1B與鐵死亡誘導劑RSL3以及標準AML治療藥物（如阿糖胞苷）的聯合治療效果。
結果圖形
（1）NSUN2促進急性髓系白血病進展并預測不良預后
研究人員分析了NSUN2在AML患者樣本中的表達水平，發現其在AML患者中顯著高于健康供體（圖1a、b），且與不良預后相關（圖1c、d）。在體外實驗中，NSUN2基因敲除的AML細胞增殖能力下降（圖1h、i），克隆形成能力減弱。在體內實驗中，NSUN2基因敲除的AML細胞在小鼠模型中形成的白血病負荷減少，生存期延長（圖1l-n）。
圖1：NSUN2促進急性髓系白血病進展并預測不良預后。
（a）GSE30029數據集中，46名AML患者與31名健康供體的CD34+骨髓（BM）細胞中NSUN2 mRNA水平。
（b）與24名健康對照相比，303名新診斷AML患者的骨髓細胞中NSUN2 mRNA表達水平。
（c）GSE12417數據集中，根據NSUN2中位數表達水平分層的AML患者的Kaplan-Meier生存分析。
（d）根據NSUN2表達水平分層的AML患者總生存Kaplan-Meier曲線（中位數截斷：NSUN2低表達，n=151；NSUN2高表達，n=152）。
（e）健康供體（N1-N3）和AML患者（P1-P6）原代骨髓樣本NSUN2蛋白水平的Western blot分析。
（f）MOLM-13和THP-1細胞用對照shRNA（shCtrl）或兩種獨立的NSUN2靶向shRNA（shNSUN2#1/#2）轉導后的NSUN2敲低效率RT-qPCR驗證。n=3。
（g）MOLM-13和THP-1細胞中NSUN2敲低后Western blot分析。
（h-i）通過CellTiter-Glo實驗分析NSUN2敲低的MOLM-13（h）和THP-1（i）細胞的細胞活性，持續5天（n=3）。
（j-k）用EdU摻入實驗定量檢測NSUN2敲低的MOLM-13（j）和THP-1（k）細胞中的增殖細胞的流式細胞術分析。
（l）通過生物發光成像監測B-NDG小鼠體內白血病負荷，這些小鼠移植了經shCtrl或shNSUN2轉導的MOLM-13-luc細胞。從7-42天，每周進行一次生物發光成像。
（m）對（l）中小鼠的生物發光信號強度（光子/秒）進行定量分析。
（n）比較移植了shCtrl和shNSUN2轉導的MOLM-13細胞的小鼠的Kaplan-Meier生存曲線。n=6。
（o）shCtrl或shNSUN2小鼠組的股骨的HE染色代表性圖像。
（p）通過流式細胞術分析骨髓（BM）和脾臟中hCD45+白血病母細胞的比例（n = 3）。
（q）在第21天被處死的小鼠的脾臟重量（n=3）。
（2）NSUN2缺失介導AML細胞對鐵死亡敏感
RNA-seq測序分析顯示，NSUN2缺失的AML細胞中細胞周期相關通路被抑制（圖2a），而鐵死亡相關通路被激活（圖2d、e）。盡管在基礎條件下，NSUN2缺失細胞并未表現出自發的脂質過氧化，但透射電子顯微鏡（TEM）觀察到其線粒體出現鐵死亡特征性的形態變化（圖2f）。在鐵死亡誘導劑（如RSL3和Erastin）處理下，NSUN2缺失的AML細胞表現出更高的鐵死亡敏感性（圖2g-j），表現為更低的半抑制。
圖2：NSUN2缺失介導AML細胞對鐵死亡敏感。
（a）基因集富集分析（GSEA）顯示，在NSUN2敲低的MOLM-13細胞中，細胞周期通路被上調。
（b）通過流式細胞術分析MOLM-13和THP-1細胞的細胞周期分布。
（c）在NSUN2敲低后，MOLM-13和THP-1細胞中細胞周期相關蛋白的Western blot分析。
（d-e）基因富集圖（d）和熱圖（e）顯示鐵死亡通路在NSUN2缺失的細胞中顯著富集。
（f）MOLM-13細胞的透射電子顯微鏡（TEM）圖像。NSUN2敲低細胞中的黃色箭頭突出了鐵死亡特征性變化，包括線粒體收縮和嵴解體。
（g-j）MOLM-13（g、i）和THP-1（h、j）細胞在對照或NSUN2敲低條件下，用RSL3或Erastin以梯度濃度處理48小時后通過CTG實驗測量細胞活性。
（k-l）對照和NSUN2敲低細胞用250 nM RSL3處理75分鐘后Fe2+探針孵育，通過流式細胞術評估。（m-n）對照和NSUN2敲低細胞用250 nM RSL3處理75分鐘后通過流式細胞術用BODIPY 581/591 C11染色評估脂質過氧化水平（m）。脂質過氧化水平的定量結果如圖（n）。
（3）FSP1表達依賴于NSUN2介導的RNA m5C修飾
NSUN2缺失導致AML細胞中RNA m5C修飾水平顯著降低（圖3a）。通過RNA-Bis-seq測序技術，研究人員鑒定出NSUN2缺失導致的m5C修飾位點變化，其中FSP1 mRNA的3’UTR區域出現多個m5C修飾位點的低甲基化（圖3g）。NSUN2缺失降低了FSP1 mRNA和蛋白水平（圖3h、i），而重新表達野生型NSUN2（非催化失活突變體）可以恢復FSP1表達。此外，NSUN2與FSP1 mRNA直接互作（圖3j），且這種相互作用依賴于m5C修飾（圖3k）。YBX1被鑒定為與FSP1 mRNA相互作用的蛋白（圖3l），其敲低也能降低FSP1水平（圖3m）。NSUN2和YBX1均能穩定FSP1 mRNA，其半衰期在NSUN2或YBX1缺失時顯著縮短（圖3n）。熒光素酶報告基因實驗表明，NSUN2和YBX1的缺失僅對野生型FSP1-3’UTR報告基因的活性產生影響，而對破壞m5C修飾位點的突變體無影響（圖3o、p）。
圖3：FSP1的表達依賴于NSUN2介導的RNA m5C修飾。
（a）通過點雜交法分析轉染shCtrl、shNSUN2#1或shNSUN2#2的MOLM-13和THP-1細胞中總RNA的m5C水平。以甲基藍（MB）染色作為裝載對照。
（b）shNSUN2與shCtrl MOLM-13細胞中，m5C位點在5’UTR、CDS、3’UTR區域密度分布。
（c）通過Bis-seq鑒定的NSUN2敲低MOLM-13細胞中差異甲基化位點的火山圖。低甲基化（藍色）和高甲基化（紅色）位點突出顯示（n=3個生物學重復）。
（d）在對照和NSUN2敲低的MOLM-13細胞中，m5C水平在染色體上的平均值。
（e）維恩圖顯示了低甲基化（Bis-seq）和表達下調（RNA-seq）的基因交集。FSP1為候選基因。
（f）在NSUN2敲低后，FSP1下調的RNA-seq結果（n=3）。
（g）在NSUN2敲低的MOLM-13細胞中，FSP1 mRNA上八個胞嘧啶殘基（C1236-C1300）的位點特異性m5C水平，通過Bis-seq定量。
（h-i）NSUN2敲低降低了MOLM-13和THP-1細胞中FSP1 mRNA（h，qPCR）和蛋白（i，Western blot）水平。
（j）使用抗NSUN2抗體的RIP-qPCR顯示，與IgG對照相比，FSP1 mRNA顯著富集（n=3）。
（k）使用m5C抗體的m5C-RIP-qPCR顯示，在NSUN2敲低細胞中，FSP1的富集度降低（n=3）。
（l）使用抗YBX1抗體的RIP-qPCR檢測MOLM-13細胞中富集的FSP1（n=3）。
（m）YBX1敲低破壞MOLM-13和THP-1細胞中FSP1蛋白表達。
（n）在轉錄終止后用5μg/ml放線菌素D進行FSP1 mRNA穩定性實驗。NSUN2敲低降低了MOLM-13細胞中FSP1的半衰期。
（o）破壞m5C位點的FSP1-3’UTR突變方案。293T細胞共轉染shNSUN2/shYBX1和報告質粒（FSP1-3’UTR-WT或FSP1-3’UTR-Mut）。
（p）熒光素酶實驗顯示，與shCtrl相比，NSUN2/YBX1敲低抑制了野生型（WT）FSP1-3’UTR的活性（n=3），但對突變構建體沒有影響。
（4）FSP1缺失顯著抑制AML體內外進展
FSP1在AML患者骨髓樣本中顯著高表達（圖4a），且其高表達與不良預后相關（圖4b-d）。在體外實驗中，FSP1基因敲除的AML細胞增殖能力下降（圖4g、h），增殖細胞比例減少（圖4i、j）。在體內實驗中，FSP1基因敲除的AML細胞在小鼠模型中形成的白血病負荷減少，生存期延長（圖4k-m），骨髓中人CD45陽性白血病細胞比例降低（圖4n），組織學檢查也顯示骨髓中白血病細胞浸潤減少（圖4o）。
圖4：FSP1缺失顯著抑制AML體內外進展。
（a）健康供體（n=24）和AML患者（n=303）骨髓細胞中FSP1表達水平的qPCR分析。
（b）TCGA-AML隊列中，根據FSP1中位數表達水平分層的AML患者的Kaplan-Meier生存分析。
（c）GSE6891隊列中，根據FSP1表達水平分層的AML患者的Kaplan-Meier曲線（FSP1低表達，n=160；FSP1高表達，n=160）。
（d）本研究隊列中，根據FSP1表達水平分層的AML患者的Kaplan-Meier曲線（FSP1低表達，n=151；FSP1高表達，n=152）。
（e-f）通過qPCR（e）和Western blotting（f）驗證了靶向FSP1（shFSP1#1或shFSP1#2）或對照shRNA（shCtrl）的shRNA轉導的MOLM-13和THP-1細胞的敲低效率。
（g-h）通過CTG實驗觀察FSP1敲低后MOLM-13（g）和THP-1（h）細胞隨時間的生長能力。
（i-j）通過EdU實驗檢測FSP1敲低的MOLM-13（i）和THP-1（j）細胞的增殖能力。
（k）通過尾靜脈注射將轉導了針對FSP1的shRNA（shFSP1）或對照shRNA（shCtrl）的MOLM-13-luc細胞注入B-NDG小鼠。在第7、14、21、28、35天通過熒光成像監測腫瘤負荷。
（l）第7、14、21天小鼠平均熒光強度的定量分析。
（m）通過log-rank檢驗確定統計學意義的B-NDG小鼠的Kaplan-Meier生存曲線，這些小鼠通過尾靜脈注射了MOLM-13-luc細胞（對照或FSP1敲低）。每組n=6。
（n）通過流式細胞術顯示股骨骨髓中hCD45陽性母細胞的比例。
（o）兩組的股骨HE染色。
（5）FSP1是NSUN2介導AML細胞鐵死亡的必要因子
RNA-seq和GSEA分析顯示，FSP1缺失的AML細胞中鐵死亡相關通路被激活（圖5b）。在鐵死亡誘導劑處理下，FSP1缺失的AML細胞存活率降低（圖5a），線粒體出現鐵死亡特征性形態變化（圖5c），脂質過氧化水平升高（圖5d-e）。重新表達野生型FSP1可以逆轉NSUN2或FSP1缺失細胞對鐵死亡誘導劑的高敏感性，降低脂質過氧化水平，而表達酶活性失活突變體FSP1-DM則無此變化（圖5d-e）。在體內實驗中，FSP1或NSUN2缺失的小鼠骨髓細胞中線粒體也表現出鐵死亡特征性形態變化（圖5f），脂質過氧化水平升高（圖5g）。
圖5：FSP1是NSUN2介導的AML細胞鐵死亡所必需的。
（a）MOLM-13和THP-1的對照或FSP1敲低細胞分別用RSL3或Erastin以梯度濃度處理48小時，通過CTG實驗測量細胞活性。
（b）FSP1敲低（shFSP1）與對照（shCtrl）MOLM-13細胞中關鍵鐵死亡相關基因表達水平通路富集分析熱圖。
（c）通過透射電子顯微鏡（TEM）拍攝的MOLM-13細胞的代表性線粒體形態。
（d-e）流式細胞術分析（d）和統計結果（e），顯示通過BODIPY 581/591 C11檢測到的脂質過氧化水平。shCtrl、shNSUN2、shFSP1以及與野生型（FSP1-WT）或突變型FSP1（FSP1-Mut）共轉染的shNSUN2的MOLM-13細胞，用載體和RSL3（200 nM）處理75分鐘。n = 3。
（f）從接受過轉導了對照（shCtrl）、FSP1敲低（shFSP1）或NSUN2敲低（shNSUN2）的MOLM-13-luc細胞的小鼠中提取的股骨骨髓細胞的TEM圖像。
（g）從接受過轉導了對照（shCtrl）、FSP1敲低（shFSP1）或NSUN2敲低（shNSUN2）的MOLM-13-luc細胞的小鼠中提取的股骨骨髓細胞的流式細胞術分析。
（6）NSUN2抑制劑MY-1B展現抗白血病活性并與RSL3及標準AML治療方案產生協同作用
NSUN2抑制劑MY-1B在多種AML細胞系中展現出抗白血病活性，其48小時IC50值在不同細胞系中有所不同（圖6a）。MY-1B處理可降低AML細胞中RNA m5C修飾水平（圖6b）和FSP1蛋白表達（圖6c）。MY-1B與鐵死亡誘導劑RSL3聯合使用時，可顯著增強脂質過氧化水平（圖6d-g），且在BLISS模型中顯示出協同作用（圖6h-i）。此外，MY-1B與標準AML化療藥物（如柔紅霉素和阿糖胞苷）聯合使用時也顯示出協同作用（圖6j-k），與BCL-2抑制劑維奈托克聯合使用時更是展現出強大的協同作用，幾乎實現完全的細胞毒性（圖6l）。在體外實驗中，MY-1B和iFSP1與鐵死亡誘導劑、化療藥物或維奈托克聯合使用時，可顯著增強細胞死亡（圖6m-n）。
圖6：NSUN2抑制劑MY-1B展現抗白血病活性并與RSL3和標準AML治療方案產生協同作用。
（a）AML細胞系（MV4-11、THP-1、MOLM-13、HL-60、OCI-AML2、OCI-AML3）經MY-1B處理48小時后的劑量-反應曲線。
（b）點雜交分析顯示經不同濃度MY-1B（0、2、4μM）處理48小時后，MOLM-13和THP-1細胞中全局RNA m5C修飾水平變化。
（c）Western blot分析顯示經MY-1B（0、2、4μM）處理48小時后，MOLM-13和THP-1細胞中FSP1蛋白表達水平的變化。
（d-g）代表性流式細胞術圖和定量分析顯示經載體、MY-1B、iFSP1、RSL3或指定組合（MY-1B + RSL3、iFSP1 + RSL3）處理75分鐘后，MOLM-13（d-e）和THP-1（f-g）細胞中脂質ROS水平的變化。
（h-i）MY-1B和RSL3組合的協同抗白血病效應。左側圖：熱圖顯示經MY-1B和RSL3以指定濃度處理48小時后，MOLM-13（h）和THP-1（i）細胞活性降低的情況。顏色梯度表示相對于未處理對照的活性百分比。右側圖：使用BLISS模型計算的相應協同效應圖。正值（橙色）表示協同作用，負值（藍色）表示拮抗作用。n=3。
（j-l）MY-1B與標準化療或維奈托克的協同效應。左側圖：MOLM-13細胞經MY-1B（0–4μM）聯合（j）柔紅霉素（DNR，0–10nM）、（k）阿糖胞苷（Ara-C，0-250nM）或（l）維奈托克（0-100nM）處理48小時后的活性矩陣。右側圖：每種組合的BLISS協同評分圖。
（m-n）藥物組合的Annexin V/PI實驗：RSL3（200nM）、柔紅霉素（DNR，7.5nM）、阿糖胞苷（Ara-C，250nM）、維奈托克（100nM）與MY-1B（4μM）或iFSP1（16μM）在MOLM-13細胞中的實驗。顯示了代表性流式細胞術圖（m）和定量分析（n）。
結論和啟示
本研究揭示了NSUN2和FSP1在AML中的重要作用，特別是其通過調控鐵死亡影響AML進展的機制。NSUN2和FSP1可作為AML的預后生物標志物和治療靶點。通過靶向NSUN2-FSP1軸，并聯合鐵死亡誘導劑或凋亡誘導劑，可克服AML治療中的耐藥性，為AML治療提供了新策略。
RNA-Bis-seq技術在本研究中的作用
RNA-Bis-seq技術在本研究中發揮了關鍵作用。通過該技術，研究人員能夠精確地鑒定NSUN2缺失對AML細胞中RNA m5C修飾的影響，特別是FSP1 mRNA的3’UTR區域的m5C修飾位點。這一發現揭示了NSUN2通過m5C修飾調控FSP1表達的分子機制，為理解NSUN2在AML中的功能提供了重要線索。此外，RNA-Bis-seq技術的應用還為類似研究提供了一個強大工具，使得研究人員能夠更深入地探索RNA修飾在疾病發生發展中的作用。
參考文獻：
Ye, W., Zhao, Y., Zhou, Y. et al. NSUN2-mediated cytosine-5 methylation of FSP1 protects acute myeloid leukemia cells from ferroptosis. Mol Cancer 24, 201 (2025). Doi:10.1186/s12943-025-02394-8
標題：NSUN2-mediated cytosine-5 methylation of FSP1 protects acute myeloid leukemia cells from ferroptosis（NSUN2介導FSP1 m5C甲基化保護急性髓系白血病細胞免受鐵死亡） 發表時間：2025年7月21日
發表期刊：Molecular Cancer
影響因子：IF33.9/Q1
技術平臺：RNA-Bis-seq（RNA-BS）、RNA-seq等
作者單位：浙江大學醫學院附屬第一醫院血液科金潔、孫杰、葉文樂等
DOI：10.1186/s12943-025-02394-8
RNA m5C是一種普遍存在的表觀轉錄組修飾，對基因表達和細胞穩態起著關鍵調控作用。盡管其在實體瘤中的作用逐漸被認識，但m5C在急性髓系白血病（AML）中的功能圖譜仍然未知。本研究通過RNA-Bis-seq等實驗揭示NSUN2（主要的RNA m5C甲基轉移酶）是AML進展的關鍵調控因子。NSUN2在AML患者樣本中異常高表達，并與不良預后相關。功能研究表明，NSUN2促進白血病細胞增殖，在異種移植模型中增強腫瘤生長，并賦予細胞對鐵死亡的抵抗力。從機制上講，NSUN2催化FSP1 mRNA 3’UTR的m5C修飾沉積，促進其被m5C reader蛋白YBX1識別和穩定。這一NSUN2-YBX1-FSP1軸通過抑制脂質過氧化和氧化損傷，保護AML細胞免受鐵死亡應激。NSUN2或FSP1缺失誘導線粒體重塑，使細胞易于發生鐵死亡。野生型NSUN2或FSP1重構建挽救鐵死亡抗性，而催化失活的NSUN2（C271A/C321A）或功能缺失的FSP1突變體（G2A/E156A）未能轉換這一表型。通過NSUN2抑制劑MY-1B或FSP1抑制劑iFSP1進行藥理學抑制表現出強大的抗白血病效應，并與鐵死亡誘導劑、標準化療和BCL-2抑制劑維奈托克（venetoclax）產生強大的協同作用。本研究揭示了NSUN2和FSP1作為AML的預后生物標志物和治療靶點。強調了將RNA甲基化與鐵死亡逃避聯系起來這一新的表觀轉錄組機制，為克服AML治療耐藥性提供了一種雙重策略方法。
易小結
本研究通過易基因提供的RNA-Bis-seq技術服務揭示了NSUN2介導的RNA m5C修飾在急性髓系白血病（AML）中的關鍵作用，特別是其通過調控FSP1表達影響AML細胞鐵死亡的新機制。
RNA-Bis-seq技術作為研究RNA修飾的強大工具，不僅揭示了NSUN2在AML中的功能機制，還為理解RNA修飾在疾病中的作用提供了新視角。該技術不僅適用于AML研究，還可廣泛應用于其他疾病的表觀轉錄組學研究，為探索基因表達調控和疾病機制提供了有力支持。
研究方法
患者樣本收集：收集303例AML患者的骨髓和外周血樣本，用于分析NSUN2和FSP1的表達水平及其與預后的關系。
細胞培養與處理：使用多種AML細胞系（如MOLM-13、THP-1等）進行實驗，包括基因敲除、過表達和藥物處理等。
RNA-Bis-seq+RNA-seq：分析NSUN2缺失對AML細胞中RNA m5C修飾的影響，鑒定NSUN2介導的m5C修飾位點；對RNA-Bis-seq和轉錄組數據關聯分析，篩選與NSUN2介導的m5C修飾相關的差異表達基因。
基因編輯技術：通過CRISPR-Cas9基因編輯技術構建NSUN2基因敲除細胞模型，以及通過慢病毒介導的過表達系統構建NSUN2和FSP1過表達細胞模型。
細胞功能實驗：包括細胞增殖實驗、克隆形成實驗、流式細胞術分析細胞周期和鐵死亡水平等，評估NSUN2和FSP1對AML細胞功能的影響。
動物模型實驗：構建NSUN2基因敲除或FSP1基因敲除的AML小鼠模型，觀察其對AML進展的影響。
藥物聯合實驗：分析NSUN2抑制劑MY-1B與鐵死亡誘導劑RSL3以及標準AML治療藥物（如阿糖胞苷）的聯合治療效果。
結果圖形
（1）NSUN2促進急性髓系白血病進展并預測不良預后
研究人員分析了NSUN2在AML患者樣本中的表達水平，發現其在AML患者中顯著高于健康供體（圖1a、b），且與不良預后相關（圖1c、d）。在體外實驗中，NSUN2基因敲除的AML細胞增殖能力下降（圖1h、i），克隆形成能力減弱。在體內實驗中，NSUN2基因敲除的AML細胞在小鼠模型中形成的白血病負荷減少，生存期延長（圖1l-n）。
圖1：NSUN2促進急性髓系白血病進展并預測不良預后。
（a）GSE30029數據集中，46名AML患者與31名健康供體的CD34+骨髓（BM）細胞中NSUN2 mRNA水平。
（b）與24名健康對照相比，303名新診斷AML患者的骨髓細胞中NSUN2 mRNA表達水平。
（c）GSE12417數據集中，根據NSUN2中位數表達水平分層的AML患者的Kaplan-Meier生存分析。
（d）根據NSUN2表達水平分層的AML患者總生存Kaplan-Meier曲線（中位數截斷：NSUN2低表達，n=151；NSUN2高表達，n=152）。
（e）健康供體（N1-N3）和AML患者（P1-P6）原代骨髓樣本NSUN2蛋白水平的Western blot分析。
（f）MOLM-13和THP-1細胞用對照shRNA（shCtrl）或兩種獨立的NSUN2靶向shRNA（shNSUN2#1/#2）轉導后的NSUN2敲低效率RT-qPCR驗證。n=3。
（g）MOLM-13和THP-1細胞中NSUN2敲低后Western blot分析。
（h-i）通過CellTiter-Glo實驗分析NSUN2敲低的MOLM-13（h）和THP-1（i）細胞的細胞活性，持續5天（n=3）。
（j-k）用EdU摻入實驗定量檢測NSUN2敲低的MOLM-13（j）和THP-1（k）細胞中的增殖細胞的流式細胞術分析。
（l）通過生物發光成像監測B-NDG小鼠體內白血病負荷，這些小鼠移植了經shCtrl或shNSUN2轉導的MOLM-13-luc細胞。從7-42天，每周進行一次生物發光成像。
（m）對（l）中小鼠的生物發光信號強度（光子/秒）進行定量分析。
（n）比較移植了shCtrl和shNSUN2轉導的MOLM-13細胞的小鼠的Kaplan-Meier生存曲線。n=6。
（o）shCtrl或shNSUN2小鼠組的股骨的HE染色代表性圖像。
（p）通過流式細胞術分析骨髓（BM）和脾臟中hCD45+白血病母細胞的比例（n = 3）。
（q）在第21天被處死的小鼠的脾臟重量（n=3）。
（2）NSUN2缺失介導AML細胞對鐵死亡敏感
RNA-seq測序分析顯示，NSUN2缺失的AML細胞中細胞周期相關通路被抑制（圖2a），而鐵死亡相關通路被激活（圖2d、e）。盡管在基礎條件下，NSUN2缺失細胞并未表現出自發的脂質過氧化，但透射電子顯微鏡（TEM）觀察到其線粒體出現鐵死亡特征性的形態變化（圖2f）。在鐵死亡誘導劑（如RSL3和Erastin）處理下，NSUN2缺失的AML細胞表現出更高的鐵死亡敏感性（圖2g-j），表現為更低的半抑制。
圖2：NSUN2缺失介導AML細胞對鐵死亡敏感。
（a）基因集富集分析（GSEA）顯示，在NSUN2敲低的MOLM-13細胞中，細胞周期通路被上調。
（b）通過流式細胞術分析MOLM-13和THP-1細胞的細胞周期分布。
（c）在NSUN2敲低后，MOLM-13和THP-1細胞中細胞周期相關蛋白的Western blot分析。
（d-e）基因富集圖（d）和熱圖（e）顯示鐵死亡通路在NSUN2缺失的細胞中顯著富集。
（f）MOLM-13細胞的透射電子顯微鏡（TEM）圖像。NSUN2敲低細胞中的黃色箭頭突出了鐵死亡特征性變化，包括線粒體收縮和嵴解體。
（g-j）MOLM-13（g、i）和THP-1（h、j）細胞在對照或NSUN2敲低條件下，用RSL3或Erastin以梯度濃度處理48小時后通過CTG實驗測量細胞活性。
（k-l）對照和NSUN2敲低細胞用250 nM RSL3處理75分鐘后Fe2+探針孵育，通過流式細胞術評估。（m-n）對照和NSUN2敲低細胞用250 nM RSL3處理75分鐘后通過流式細胞術用BODIPY 581/591 C11染色評估脂質過氧化水平（m）。脂質過氧化水平的定量結果如圖（n）。
（3）FSP1表達依賴于NSUN2介導的RNA m5C修飾
NSUN2缺失導致AML細胞中RNA m5C修飾水平顯著降低（圖3a）。通過RNA-Bis-seq測序技術，研究人員鑒定出NSUN2缺失導致的m5C修飾位點變化，其中FSP1 mRNA的3’UTR區域出現多個m5C修飾位點的低甲基化（圖3g）。NSUN2缺失降低了FSP1 mRNA和蛋白水平（圖3h、i），而重新表達野生型NSUN2（非催化失活突變體）可以恢復FSP1表達。此外，NSUN2與FSP1 mRNA直接互作（圖3j），且這種相互作用依賴于m5C修飾（圖3k）。YBX1被鑒定為與FSP1 mRNA相互作用的蛋白（圖3l），其敲低也能降低FSP1水平（圖3m）。NSUN2和YBX1均能穩定FSP1 mRNA，其半衰期在NSUN2或YBX1缺失時顯著縮短（圖3n）。熒光素酶報告基因實驗表明，NSUN2和YBX1的缺失僅對野生型FSP1-3’UTR報告基因的活性產生影響，而對破壞m5C修飾位點的突變體無影響（圖3o、p）。
圖3：FSP1的表達依賴于NSUN2介導的RNA m5C修飾。
（a）通過點雜交法分析轉染shCtrl、shNSUN2#1或shNSUN2#2的MOLM-13和THP-1細胞中總RNA的m5C水平。以甲基藍（MB）染色作為裝載對照。
（b）shNSUN2與shCtrl MOLM-13細胞中，m5C位點在5’UTR、CDS、3’UTR區域密度分布。
（c）通過Bis-seq鑒定的NSUN2敲低MOLM-13細胞中差異甲基化位點的火山圖。低甲基化（藍色）和高甲基化（紅色）位點突出顯示（n=3個生物學重復）。
（d）在對照和NSUN2敲低的MOLM-13細胞中，m5C水平在染色體上的平均值。
（e）維恩圖顯示了低甲基化（Bis-seq）和表達下調（RNA-seq）的基因交集。FSP1為候選基因。
（f）在NSUN2敲低后，FSP1下調的RNA-seq結果（n=3）。
（g）在NSUN2敲低的MOLM-13細胞中，FSP1 mRNA上八個胞嘧啶殘基（C1236-C1300）的位點特異性m5C水平，通過Bis-seq定量。
（h-i）NSUN2敲低降低了MOLM-13和THP-1細胞中FSP1 mRNA（h，qPCR）和蛋白（i，Western blot）水平。
（j）使用抗NSUN2抗體的RIP-qPCR顯示，與IgG對照相比，FSP1 mRNA顯著富集（n=3）。
（k）使用m5C抗體的m5C-RIP-qPCR顯示，在NSUN2敲低細胞中，FSP1的富集度降低（n=3）。
（l）使用抗YBX1抗體的RIP-qPCR檢測MOLM-13細胞中富集的FSP1（n=3）。
（m）YBX1敲低破壞MOLM-13和THP-1細胞中FSP1蛋白表達。
（n）在轉錄終止后用5μg/ml放線菌素D進行FSP1 mRNA穩定性實驗。NSUN2敲低降低了MOLM-13細胞中FSP1的半衰期。
（o）破壞m5C位點的FSP1-3’UTR突變方案。293T細胞共轉染shNSUN2/shYBX1和報告質粒（FSP1-3’UTR-WT或FSP1-3’UTR-Mut）。
（p）熒光素酶實驗顯示，與shCtrl相比，NSUN2/YBX1敲低抑制了野生型（WT）FSP1-3’UTR的活性（n=3），但對突變構建體沒有影響。
（4）FSP1缺失顯著抑制AML體內外進展
FSP1在AML患者骨髓樣本中顯著高表達（圖4a），且其高表達與不良預后相關（圖4b-d）。在體外實驗中，FSP1基因敲除的AML細胞增殖能力下降（圖4g、h），增殖細胞比例減少（圖4i、j）。在體內實驗中，FSP1基因敲除的AML細胞在小鼠模型中形成的白血病負荷減少，生存期延長（圖4k-m），骨髓中人CD45陽性白血病細胞比例降低（圖4n），組織學檢查也顯示骨髓中白血病細胞浸潤減少（圖4o）。
圖4：FSP1缺失顯著抑制AML體內外進展。
（a）健康供體（n=24）和AML患者（n=303）骨髓細胞中FSP1表達水平的qPCR分析。
（b）TCGA-AML隊列中，根據FSP1中位數表達水平分層的AML患者的Kaplan-Meier生存分析。
（c）GSE6891隊列中，根據FSP1表達水平分層的AML患者的Kaplan-Meier曲線（FSP1低表達，n=160；FSP1高表達，n=160）。
（d）本研究隊列中，根據FSP1表達水平分層的AML患者的Kaplan-Meier曲線（FSP1低表達，n=151；FSP1高表達，n=152）。
（e-f）通過qPCR（e）和Western blotting（f）驗證了靶向FSP1（shFSP1#1或shFSP1#2）或對照shRNA（shCtrl）的shRNA轉導的MOLM-13和THP-1細胞的敲低效率。
（g-h）通過CTG實驗觀察FSP1敲低后MOLM-13（g）和THP-1（h）細胞隨時間的生長能力。
（i-j）通過EdU實驗檢測FSP1敲低的MOLM-13（i）和THP-1（j）細胞的增殖能力。
（k）通過尾靜脈注射將轉導了針對FSP1的shRNA（shFSP1）或對照shRNA（shCtrl）的MOLM-13-luc細胞注入B-NDG小鼠。在第7、14、21、28、35天通過熒光成像監測腫瘤負荷。
（l）第7、14、21天小鼠平均熒光強度的定量分析。
（m）通過log-rank檢驗確定統計學意義的B-NDG小鼠的Kaplan-Meier生存曲線，這些小鼠通過尾靜脈注射了MOLM-13-luc細胞（對照或FSP1敲低）。每組n=6。
（n）通過流式細胞術顯示股骨骨髓中hCD45陽性母細胞的比例。
（o）兩組的股骨HE染色。
（5）FSP1是NSUN2介導AML細胞鐵死亡的必要因子
RNA-seq和GSEA分析顯示，FSP1缺失的AML細胞中鐵死亡相關通路被激活（圖5b）。在鐵死亡誘導劑處理下，FSP1缺失的AML細胞存活率降低（圖5a），線粒體出現鐵死亡特征性形態變化（圖5c），脂質過氧化水平升高（圖5d-e）。重新表達野生型FSP1可以逆轉NSUN2或FSP1缺失細胞對鐵死亡誘導劑的高敏感性，降低脂質過氧化水平，而表達酶活性失活突變體FSP1-DM則無此變化（圖5d-e）。在體內實驗中，FSP1或NSUN2缺失的小鼠骨髓細胞中線粒體也表現出鐵死亡特征性形態變化（圖5f），脂質過氧化水平升高（圖5g）。
圖5：FSP1是NSUN2介導的AML細胞鐵死亡所必需的。
（a）MOLM-13和THP-1的對照或FSP1敲低細胞分別用RSL3或Erastin以梯度濃度處理48小時，通過CTG實驗測量細胞活性。
（b）FSP1敲低（shFSP1）與對照（shCtrl）MOLM-13細胞中關鍵鐵死亡相關基因表達水平通路富集分析熱圖。
（c）通過透射電子顯微鏡（TEM）拍攝的MOLM-13細胞的代表性線粒體形態。
（d-e）流式細胞術分析（d）和統計結果（e），顯示通過BODIPY 581/591 C11檢測到的脂質過氧化水平。shCtrl、shNSUN2、shFSP1以及與野生型（FSP1-WT）或突變型FSP1（FSP1-Mut）共轉染的shNSUN2的MOLM-13細胞，用載體和RSL3（200 nM）處理75分鐘。n = 3。
（f）從接受過轉導了對照（shCtrl）、FSP1敲低（shFSP1）或NSUN2敲低（shNSUN2）的MOLM-13-luc細胞的小鼠中提取的股骨骨髓細胞的TEM圖像。
（g）從接受過轉導了對照（shCtrl）、FSP1敲低（shFSP1）或NSUN2敲低（shNSUN2）的MOLM-13-luc細胞的小鼠中提取的股骨骨髓細胞的流式細胞術分析。
（6）NSUN2抑制劑MY-1B展現抗白血病活性并與RSL3及標準AML治療方案產生協同作用
NSUN2抑制劑MY-1B在多種AML細胞系中展現出抗白血病活性，其48小時IC50值在不同細胞系中有所不同（圖6a）。MY-1B處理可降低AML細胞中RNA m5C修飾水平（圖6b）和FSP1蛋白表達（圖6c）。MY-1B與鐵死亡誘導劑RSL3聯合使用時，可顯著增強脂質過氧化水平（圖6d-g），且在BLISS模型中顯示出協同作用（圖6h-i）。此外，MY-1B與標準AML化療藥物（如柔紅霉素和阿糖胞苷）聯合使用時也顯示出協同作用（圖6j-k），與BCL-2抑制劑維奈托克聯合使用時更是展現出強大的協同作用，幾乎實現完全的細胞毒性（圖6l）。在體外實驗中，MY-1B和iFSP1與鐵死亡誘導劑、化療藥物或維奈托克聯合使用時，可顯著增強細胞死亡（圖6m-n）。
圖6：NSUN2抑制劑MY-1B展現抗白血病活性并與RSL3和標準AML治療方案產生協同作用。
（a）AML細胞系（MV4-11、THP-1、MOLM-13、HL-60、OCI-AML2、OCI-AML3）經MY-1B處理48小時后的劑量-反應曲線。
（b）點雜交分析顯示經不同濃度MY-1B（0、2、4μM）處理48小時后，MOLM-13和THP-1細胞中全局RNA m5C修飾水平變化。
（c）Western blot分析顯示經MY-1B（0、2、4μM）處理48小時后，MOLM-13和THP-1細胞中FSP1蛋白表達水平的變化。
（d-g）代表性流式細胞術圖和定量分析顯示經載體、MY-1B、iFSP1、RSL3或指定組合（MY-1B + RSL3、iFSP1 + RSL3）處理75分鐘后，MOLM-13（d-e）和THP-1（f-g）細胞中脂質ROS水平的變化。
（h-i）MY-1B和RSL3組合的協同抗白血病效應。左側圖：熱圖顯示經MY-1B和RSL3以指定濃度處理48小時后，MOLM-13（h）和THP-1（i）細胞活性降低的情況。顏色梯度表示相對于未處理對照的活性百分比。右側圖：使用BLISS模型計算的相應協同效應圖。正值（橙色）表示協同作用，負值（藍色）表示拮抗作用。n=3。
（j-l）MY-1B與標準化療或維奈托克的協同效應。左側圖：MOLM-13細胞經MY-1B（0–4μM）聯合（j）柔紅霉素（DNR，0–10nM）、（k）阿糖胞苷（Ara-C，0-250nM）或（l）維奈托克（0-100nM）處理48小時后的活性矩陣。右側圖：每種組合的BLISS協同評分圖。
（m-n）藥物組合的Annexin V/PI實驗：RSL3（200nM）、柔紅霉素（DNR，7.5nM）、阿糖胞苷（Ara-C，250nM）、維奈托克（100nM）與MY-1B（4μM）或iFSP1（16μM）在MOLM-13細胞中的實驗。顯示了代表性流式細胞術圖（m）和定量分析（n）。
結論和啟示
本研究揭示了NSUN2和FSP1在AML中的重要作用，特別是其通過調控鐵死亡影響AML進展的機制。NSUN2和FSP1可作為AML的預后生物標志物和治療靶點。通過靶向NSUN2-FSP1軸，并聯合鐵死亡誘導劑或凋亡誘導劑，可克服AML治療中的耐藥性，為AML治療提供了新策略。
RNA-Bis-seq技術在本研究中的作用
RNA-Bis-seq技術在本研究中發揮了關鍵作用。通過該技術，研究人員能夠精確地鑒定NSUN2缺失對AML細胞中RNA m5C修飾的影響，特別是FSP1 mRNA的3’UTR區域的m5C修飾位點。這一發現揭示了NSUN2通過m5C修飾調控FSP1表達的分子機制，為理解NSUN2在AML中的功能提供了重要線索。此外，RNA-Bis-seq技術的應用還為類似研究提供了一個強大工具，使得研究人員能夠更深入地探索RNA修飾在疾病發生發展中的作用。
參考文獻：
Ye, W., Zhao, Y., Zhou, Y. et al. NSUN2-mediated cytosine-5 methylation of FSP1 protects acute myeloid leukemia cells from ferroptosis. Mol Cancer 24, 201 (2025). Doi:10.1186/s12943-025-02394-8
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