技術(shù)突破：三光子活體成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)1700μm亞細(xì)胞分辨率成像_abio生物試劑品牌網(wǎng)
該研究由Falko Fuhrmann、Felix C. Nebeling、Fabrizio Musacchio等學(xué)者共同完成，文章題為《Three-photon in vivo imaging of neurons and glia in the medial prefrontal cortex with sub-cellular resolution》，于2025年5月在線發(fā)表于《Communications Biology》。
重要發(fā)現(xiàn)
01三光子成像技術(shù)的搭建與優(yōu)化
為了實(shí)現(xiàn)對mPFC的深層活體成像，研究團(tuán)隊(duì)搭建了一套先進(jìn)的三光子顯微鏡系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用了可調(diào)諧激光（1300-1700nm），激光重復(fù)頻率穩(wěn)定在2MHz，并配備了900-1900nm鍍膜光學(xué)元件，確保長波長激發(fā)光的有效傳輸。
關(guān)鍵的技術(shù)優(yōu)化包括：
色散補(bǔ)償，通過棱鏡補(bǔ)償器減少飛秒激光在光路中的脈沖展寬，提升熒光激發(fā)效率，使1mm深度處的高亮度熒光信號更豐富，信噪比顯著提高；
物鏡選擇，對比多款物鏡后，選用了Olympus25x水浸物鏡（數(shù)值孔徑1.05，傳輸波長至1700nm），其在1mm深度的熒光強(qiáng)度和信噪比表現(xiàn)最優(yōu)；
擴(kuò)大探測光學(xué)元件尺寸，增加非彈道光子的收集角度（從8°增至14°），進(jìn)一步提升信號質(zhì)量。這些優(yōu)化讓系統(tǒng)能穿透小鼠顱骨窗口，清晰成像mPFC的各個(gè)區(qū)域和層級。
02 深層組織成像的核心成果在神經(jīng)元成像方面，研究團(tuán)隊(duì)在清醒固定的小鼠中，利用1300nm波長激發(fā)表達(dá)GCaMP6s的興奮性神經(jīng)元，在1400μm深度記錄到240多個(gè)神經(jīng)元的鈣瞬變，平均振幅為4.95±4.14[%ΔF/F]，半寬為3.24±2.25秒，成功捕捉到深層神經(jīng)元的活動(dòng)動(dòng)態(tài)。
對于星形膠質(zhì)細(xì)胞，團(tuán)隊(duì)通過表達(dá)GCaMP5g的小鼠模型，在1200μm深度觀察到其鈣活動(dòng)，包括離散微域的自發(fā)鈣事件和胞體的鈣變化，且這些活動(dòng)的振幅、持續(xù)時(shí)間和頻率與淺層星形膠質(zhì)細(xì)胞相似，表明深層星形膠質(zhì)細(xì)胞的基礎(chǔ)功能特性具有一致性。
在小膠質(zhì)細(xì)胞研究中，使用1650nm波長激發(fā)紅色熒光標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞，首次在1100μm深度量化其突起的運(yùn)動(dòng)性，發(fā)現(xiàn)其周轉(zhuǎn)率為58.9±2%，且連續(xù)兩天成像顯示運(yùn)動(dòng)特性穩(wěn)定，證明該技術(shù)的低侵入性。
此外，研究還實(shí)現(xiàn)了樹突棘密度的長期追蹤：在1mm以下深度，連續(xù)一周記錄到樹突棘密度為0.41±0.07μm?1，為研究神經(jīng)元結(jié)構(gòu)可塑性提供了新工具。
創(chuàng)新與亮點(diǎn)
01突破傳統(tǒng)成像的深度瓶頸
傳統(tǒng)雙光子成像受限于光散射，在腦組織中的成像深度通常不足1mm，且難以實(shí)現(xiàn)亞細(xì)胞分辨率。而本研究的三光子成像技術(shù)通過采用1300-1700nm的長波長激光，顯著減少了光在深層組織中的散射和吸收，將成像深度提升至1700μm，是雙光子成像的1.5倍以上。這一突破讓科研人員得以探索mPFC等以往難以觸及的深層腦區(qū)，為理解全腦網(wǎng)絡(luò)連接打開了新窗口。
以往研究mPFC常依賴侵入性的GRIN透鏡或微棱鏡，這些方法會(huì)損傷腦組織且成像范圍有限。本技術(shù)通過顱骨窗口實(shí)現(xiàn)非侵入式成像，避免了對腦結(jié)構(gòu)的破壞。更重要的是，它能在1mm以下深度對同一批樹突棘進(jìn)行連續(xù)一周的追蹤，且小膠質(zhì)細(xì)胞在連續(xù)成像后仍保持正常運(yùn)動(dòng)特性，熱休克蛋白檢測呈陰性，證明其對細(xì)胞的干擾極小，為長期觀察神經(jīng)可塑性和疾病進(jìn)展提供了可靠手段。
03 多細(xì)胞類型的亞細(xì)胞分辨率成像
該技術(shù)首次在深層組織中同時(shí)實(shí)現(xiàn)了神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的亞細(xì)胞分辨率成像。例如，能清晰觀察到1000μm深度樹突棘的形態(tài)（1-2μm大?。?，量化小膠質(zhì)細(xì)胞突起的細(xì)微運(yùn)動(dòng)（5μm尺度），以及星形膠質(zhì)細(xì)胞微域的鈣信號變化。這種多維度成像能力，讓科研人員能同時(shí)研究不同細(xì)胞類型在深層腦區(qū)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)聯(lián)，為揭示神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的協(xié)同作用提供了關(guān)鍵工具。
04 技術(shù)應(yīng)用的廣泛價(jià)值
mPFC與工作記憶、決策、情緒調(diào)控等高級認(rèn)知功能密切相關(guān)，其功能異常與精神分裂癥、自閉癥、阿爾茨海默病等多種疾病相關(guān)。三光子成像技術(shù)的出現(xiàn)，為這些疾病的機(jī)制研究提供了直接觀察mPFC細(xì)胞活動(dòng)的手段。例如，可通過追蹤樹突棘密度變化了解精神疾病中的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)異常，或通過小膠質(zhì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性變化監(jiān)測神經(jīng)炎癥程度，有望加速疾病標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和新藥研發(fā)。
總結(jié)與展望
本研究成功開發(fā)并應(yīng)用三光子活體成像技術(shù)，在小鼠mPFC實(shí)現(xiàn)了1700μm深度的亞細(xì)胞分辨率成像，首次同時(shí)記錄了神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能特性，突破了傳統(tǒng)成像技術(shù)的深度和侵入性限制。
展望未來，該技術(shù)將成為探索mPFC在認(rèn)知功能（如工作記憶、情緒調(diào)控）中作用的核心工具，助力揭示阿爾茨海默病、精神分裂癥等疾病的發(fā)病機(jī)制。同時(shí)，其在深層組織成像中的優(yōu)勢也有望擴(kuò)展到其他器官研究，推動(dòng)整個(gè)生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域的發(fā)展，為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和神經(jīng)科學(xué)研究帶來革命性突破。
論文信息聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Fuhrmann F, Nebeling FC, Musacchio F, Mittag M, Poll S, Müller M, Ambrad Giovannetti E, MAIbach M, Schaffran B, Burnside E, Chan ICW, Lagurin AS, Reichenbach N, Kaushalya S, Fried H, Linden S, Petzold GC, Tavosanis G, Bradke F, Fuhrmann M. Three-photon in vivo imaging of neurons and glia in the medial prefrontal cortex with sub-cellular resolution. Commun Biol. 2025 May 23;8(1):795.
DOI:10.1038/s42003-025-08079-8.
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