從光到思維：共聚焦顯微鏡中的檢測器和測量技術（中）_abio生物試劑品牌網
為什么混合探測器允許在更高強度下進行光子計數，以及為什么直方圖有時看起來會很奇怪
本文概述了共聚焦顯微鏡中常用的重要檢測器。
“共聚焦顯微鏡”在此特指“真共聚焦掃描”，即僅對單點進行激發和測量的技術。本文旨在為用戶提供不同技術之間清晰的概覽，并針對不同應用場景給出合適的檢測器選擇建議，而非深入探討專業細節。
測量方法和直方圖
到達陽極的電荷云會產生一個電壓脈沖。更準確地說， 施加在高壓上的正電位會被到達的負電荷以脈沖形式略微衰減。此時的電荷是可測量的，但仍然非常微弱。因此，需要進行仔細的設計以確保獲得有意義的測量結果。基本上，有三種不同的測量概念，將在下文概述。這些概念適用于所有類型的檢測器，包括“雪崩光電二極管”和“混合探測器”章節中描述的雪崩光電二極管和混合探測器。然而，這些方法并非對所有檢測器都同樣適用。
我們在此也想探討一下評估方法，因為用戶與其說是對檢測器的工作原理感興趣，不如說是更關心這些信號對其測量和研究的意義。
電荷放大器
圖6：檢測器S在吸收一個光量子hν后產生電荷Q。該電荷由一個運算放大器進行累加。運算放大器（OP）確保其反相輸入端（–）的電壓始終等于同相輸入端（+）的電壓。因此，當來自PMT陽極的電荷到達時，會立即通過對電容器C充電來進行補償（紅色圓圈）。然后，電容器上的電荷對應于在整個測量時間內到達的電荷，輸出電壓Ua與C成正比，因此可以進行測量。在一個像素的測量結束后，系統會被重置為零。
測量PMT信號的傳統技術是使用所謂的電荷放大器。在掃描顯微鏡中，激發光束持續掃描樣品，每條掃描線都需要劃分為所需數量的像素。對于經典的結構圖像，典型的記錄時間約為一秒，每幅圖像包含1000條掃描線，每條線包含1000個像素。因此，每個像素的記錄時間約為1微秒。在這1微秒內，來自PMT的所有電荷都會在電容器中累積，如圖7所示。總時間的一部分會用于重置電荷放大器，以便其在下一個像素的測量時重新從零開始。最終得到一個與從PMT接收的總電荷成正比的電壓。然后，該電壓通過模數轉換器（ADC）轉換為“灰度值”。通常使用8位分辨率，即灰度值是介于0和255之間的整數。通過調節PMT的高壓，可以確保測得的信號“落入”這8位范圍內，即充分利用整個動態范圍，而不會因過載而導致信號截斷。
圖7：使用電荷放大器進行測量時，在一個像素的時間段內，電荷脈沖（藍色）和積分信號（紅色）的變化。亮度讀數是最終的積分值。然后在重置階段對電容器進行放電，以便開始下一個像素的測量。
顯然，這些灰度值并不代表絕對亮度值，而只能用于比較不同圖像區域的相對亮度，或者比較在相同測量設置下采集的圖像的亮度。如上所述，每個入射光子的信號強度變化很大。在一個圖像元素的亮度測量時間內，會有若干甚至許多光子入射。可能的取值是單個光子電荷的所有組合，這些組合本身就是準連續變化的。 因此，累積測量中的光子事件完全模糊，信號強度呈現連續分布。數字化過程則將這種連續分布轉換為256個離散的亮度值，即灰度值。
圖8：植物根莖切片的雙通道圖像。感興趣區域用黃線標出。大部分區域是黑色背景，在直方圖的左側區域，即低灰度值區域，表現為非常高的峰值。為了使實際信號的直方圖清晰可見，計數被限制為僅顯示非背景結果。紅色通道的信號是紅色直方圖中的肩部（介于80和200灰度值之間）。
當然，實驗人員通常并不關注單個圖像元素的亮度，而是 關注諸如完整細胞或組織成分等結構的強度。因此，他們會選擇一個感興趣區域（ROI）并獲取其亮度值。根據圖像分辨率（通常約為1000 x 1000像素，即1百萬像素），數百甚至數千個圖像元素會被組合成一個單一的數值。然后，可以將該平均值與其他結構的值進行比較，或者在活體材料實驗中將其繪制為時間變化曲線等。例如，還可以更精確地分析該區域內的亮度分布。為此，需要生成一個直方圖，統計具有特定亮度的圖像元素數量。由于有256種不同的亮度級別，因此在8位直方圖的x軸上會顯示從0到255的數字。由于數字化過程，這里不存在中間值。因此，嚴格來說，直方圖中不應存在連續的線條。此外，y軸上繪制的頻率也只能是整數，這很合理，因為它們代表圖像元素的數量。圖8展示了一個此類直方圖。我們可以從該直方圖中提取各種細節；這里我們主要關注三個屬性。
如果亮度分布是對稱的，則平均亮度值位于直方圖的最大值處。然而，我們經常會觀察到某種程度的不對稱性，表明平均值略微偏離最大值，可能偏左或偏右。
對于極端的亮度波動，曲線會變得非常“寬”。如果沒有方差，則只會有一個灰度值，“曲線”將無限窄。因此，寬度是方差的體現。然而，影響這種方差的因素不僅是每次測量時間內到達圖像元素的 photons 數量分布，還包括測量系統的噪聲特性，尤其是PMT以及電子設備的噪聲。只有當這些噪聲部分足夠小時，才有可能根據平均值與寬度的比率來估計 contributing photons 的數量。
由于零點由電子設備的設置固定，因此無法從灰度值直方圖中推斷出背景亮度中PMT暗電流的比例。
為了獲得可用的圖像，需要大約為3的信噪比（SNR）。當在圖像元素中記錄到10個光子時，即可達到此信噪比。對于線頻為1 kHz的1百萬像素圖像，這意味著每秒有1000萬個光子入射。然而，通常我們會盡量使用較弱的光照，因為高強度激發會破壞熒光染料，且產生的分解產物通常對生物體有害。 因此，需要降低激發強度，以在圖像質量和樣本穩定性之間取得平衡。因此，每個像素通常只記錄到平均1到3個甚至更少的光子。即使信號極其微弱，只要每個像素的平均光子數遠小于1，仍然可以進行有效的評估。
為什么即使只有10個光子，我們也能獲得遠超過200種不同的灰度值？15種不同的亮度級別難道不夠嗎？如果每個光子在圖像中產生相同的信號，那么15級就足夠了。但是，正如我們上面所述，脈沖高度變化很大（強度存在噪聲）。如果一個像素中累加了多個光子的脈沖，則可能的亮度值數量會再次增加。這就是亮度級別數量龐大的原因。而且，使用的級別越多（例如使用約12或16位的較低灰度分辨率），我們就越會放大脈沖變化產生的噪聲。然而，這樣做并不能提供更好的信息。
圖9：上圖：如果圖像中只使用了少量灰度級，則直方圖僅在狹窄的范圍內顯示數值。下圖：如果將這些灰度級乘以一個系數，以充分利用8位動態范圍（例如，為了使顯示器上的圖像更易于觀察），則灰度級的數量保持不變，中間的級別仍然為空，從而導致直方圖中出現“間隙”。
直方圖還提供其他有用的信息。如果在記錄過程中沒有充分利用0到255的完整動態范圍，而只使用了底部十分之一（0到25），則顯示器上的圖像會非常暗，因為顯示器只使用了0到25的灰度值。我們只能通過“擴展”直方圖來使圖像變亮，這是當今所有數碼相機都自動提供的常用技術。這種方法是將每個像素的亮度值乘以相同的系數Z。在上述情況下，我們需要將所有值乘以10，以覆蓋0到255的范圍。然而，由于最初只有25個不同的值，因此最終圖像中也只有25個不同的值。因此，直方圖會出現間隙；在我們的示例中，所有繪制的灰度值之間都缺少9個值。因此，圖表看起來有些“雜亂”，但數據是正確的。
雖然電荷放大器多年來一直用作共聚焦顯微鏡上測量PMT信號的設備，但它現在已基本被其他技術取代（見下文）。電荷放大器提供的信號是對整個像素時間內的信號進行積分，因此結果取決于像素時間的長度。然而，如果改變掃描格式（例如，在相同的掃描速度下，每行只記錄100個而不是1000個像素），則像素時間會發生變化。此時信號會增大10倍，因此需要調整PMT上的高壓。改變掃描速度也會產生相同的效果。此外，由于電荷放大器的復位需要一定的時間，因此每個像素的測量時間都會損失一部分。 在高掃描速度和高分辨率下，像素時間非常短，復位造成的損失會變得顯著。直接數字化可以解決這個問題。
直接數字化
圖10：與圖7中相同的光子事件。與高保真技術類似，PMT輸出端的信號以高頻率直接數字化（紅色星號）。數字化頻率（采樣時鐘）設置得足夠高，以高于測量系統的電子帶寬（“過采樣”），從而確保信號被完整捕獲。
現代數字化電路的速度足夠快，能夠直接將PMT信號轉換為數字量。具體方法是通過一個適當阻值的電阻對PMT產生的電荷進行放電，并以高時鐘頻率將由此產生的電壓轉換為灰度值。單個圖像元素的數據在記錄過程中會立即進行平均，因此，無論記錄一個圖像元素需要多長時間，圖像最終獲得的灰度值都能真實地反映樣本的強度。采用這種方法，無需重新調整PMT的高壓，可以直接比較亮度值。此外，也不存在因復位而造成的時間損失。
使用直接數字化方法獲得的直方圖與使用電荷放大器時獲得的直方圖看起來完全相同，并且基本上包含相同的信息。這是因為平均方法本質上也是對測量數據進行累加，只不過是立即在正確的時間軸上進行縮放。掃描變焦也不會改變圖像亮度，除非是由于不同程度的熒光染料漂白等原因造成的真實亮度變化——但這屬于有價值的信息，而不是測量偽影。漂白現象也可以通過這種方法立即進行量化。
這項技術的另一個優點是不存在因清空存儲器而造成的死時間。這使得在極短的像素時間內能夠獲得更好的信噪比。
光子計數
我們現在可以使用清晰簡潔的直方圖來描述強度。然而，有趣的是，世界遠非如此平滑和連續。正如馬克斯·普朗克[7]無意中發現的那樣，光并非以連續強度的形式存在。因此，我們的探測器測量的是單個事件——光子的到達，而不是連續的強度值。表面上的連續性是測量上的模糊性造成的：PMT模擬測量的直方圖顯示的是模糊測量的合并結果。正如我們已經提到的，PMT接收到的每個光子都會產生一個寬度變化的脈沖，其強度先上升后下降。通過對大量寬度和高度不同的脈沖進行積分或平均，可以獲得一個看似連續的亮度直方圖，其中可以出現任何強度值。此外，這些強度值的數量取決于數據記錄中人為設定的“灰度深度”。然而，事實并非如此。仔細考慮后會發現，像素中的亮度不能用有理數表示。它只能是一個整數，事實上，它只能是在該像素的測量時間內到達探測器的光子確切數量。因此，與其對每個脈沖的電荷（即脈沖曲線下的面積）進行積分或平均，不如直接計數到達陽極的電荷脈沖，而不評估脈沖大小。這將解決大部分噪聲問題。
* 事實上，光強也取決于光子的顏色，這會對脈沖高度產生輕微影響。然而，這種能量差異在整個光譜范圍內僅約為2電子伏特。與第一個倍增極上約80伏特的電壓相比，這可以忽略不計。對于下文將討論的混合探測器（HyD），這種變化甚至要小一百倍左右。
光電子的初始速度也存在類似情況，正如我們之前提到的，光電子可以從陰極向任何方向發射。一些光電子會朝著期望的方向運動，而另一些則需要通過改變方向來加速，這會導致它們撞擊倍增極時的動能有所損失。這種動能的變化范圍也在±2電子伏特左右。
圖11：與圖7和圖10中相同的光子事件。對單個光子產生的電荷脈沖進行計數稱為“光子計數”。雖然這項技術產生的噪聲遠低于電荷放大，但它只能應用于高度相似且不會相互重疊的脈沖。此外，較小的脈沖可能無法被識別。
如今，這種計數器在電子學中已成為標準配置。脈沖的高度或斜率用于激活一個觸發器，每次觸發計數器值加1。在一個像素的測量結束時，計數器會被重置為0（這個過程幾乎不耗時），然后重新開始計數。然而，這種方法的局限性在圖11中顯而易見：脈沖必須能夠被單獨分辨。如果第二個脈沖在第一個脈沖期間發生，則只會檢測到一個脈沖，導致后續測量的亮度值偏低。脈沖是否能夠分離取決于脈沖之間的時間間隔和脈沖寬度。較寬的脈沖只適用于較低的亮度，因為否則脈沖之間會過于接近，容易發生重疊。較窄的脈沖即使在高強度（即較短的脈沖間隔）下也能產生良好的計數結果。
典型的PMT輸出的脈沖寬度約為20納秒，可以有效區分。如果光子總是以相同的時間間隔到達，則計數率可高達每秒5000萬次（50 Mcps）。然而，由于光子的到達是隨機的，脈沖重疊的概率會大大增加，從而降低了最高計數率。這里所說的最高計數率是指，當超過該計數率時，實際觸發的光電子數量與測量到的脈沖數量之間的關系不再呈線性。誠然，這是一個取決于誤差容限的任意定義。如果允許的偏差僅為1%，則線性關系會在0.5 Mcps時結束；如果允許10%的偏差，則線性關系會在5 Mcps時結束。在日常實踐中，1%的精度通常難以達到，而10%則超過了容忍閾值。例如，可以將閾值設定為6%，從而在計數率略高于10 Mcps時獲得有效的測量結果。
如果我們暫時假設沒有亮度波動（例如，通過照射一個固定點，不進行掃描），則光子平均會均勻地到達探測器，但其到達是隨機的。在這種泊松過程中，光子之間的時間間隔可以用指數分布來描述。我們無需在此深入探討細節，只需說明此過程可以用精確的數學術語來描述。在一定程度上，我們可以利用它來計算由脈沖重疊引起的、導致線性偏差的誤差。然而，如果已知誤差，我們就可以使用測得的脈沖數反推實際到達的脈沖數。這種方法在未經校正時誤差變得顯著的脈沖率的五倍范圍內有效。因此，這種校正方法被稱為線性化。這是一種用于擴展測量范圍的、廣為人知且有充分描述的方法[7]。
圖 12：圖12：通過校正統計概率實現計數率的線性化。請注意對數x軸[6]。
與原始計數的脈沖（對應于光子）不同，這種線性化方法（類似于展寬）在計算中會產生小數以及整數。這反過來會影響直方圖，因為直方圖通常只繪制整數，例如灰度值。無論如何，這些能量通道的寬度通常總是恒定的，并且總是可以將任何小數轉換為整數，例如從0開始然后簡單地繼續計數。因此，線性化會導致直方圖中出現拍頻效應，從而使個別能量值遠超出直方圖的包絡線。雖然起初可能令人困惑，但這是對統計校正后的光子數的精確表示。
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參考文獻：
[1] Becquerel AE: Mémoire sur les effets électriques produits sous l’influence des rayons solAIres. Comptes Rendus 9: 561–67 (1839).
[2] Hertz HR: Ueber den Einfluss des ultravioletten Lichtes auf die electrische Entladung. Annalen der Physik 267 (8): 983–1000 (1887).
[3] Hallwachs WLF: Ueber die Electrisierung von Metallplatten durch Bestrahlung mit electrischem Licht. Annalen der Physik 34: 731–34 (1888).
[4] Einstein A: Ueber einen die Erzeugung und Verwandlung des Lichtes betreffenden heuristischen Gesichtspunkt. Annalen der Physik 322 (6): 132–48 (1905).
[5] Newton I: Opticks. Or, A Treatise of the Reflections, Refractions, Inflections and Colours of Light (1704).
[6] Planck M: Ueber irreversible Strahlungsvorg?nge. Ann. Phys, 1: 69–122 (1900).
[7] Hamamatsu Photonics KK: Photomultiplier Tubes – Basics and Applications. Ed. 3a: 310 (2007).
本文概述了共聚焦顯微鏡中常用的重要檢測器。
“共聚焦顯微鏡”在此特指“真共聚焦掃描”，即僅對單點進行激發和測量的技術。本文旨在為用戶提供不同技術之間清晰的概覽，并針對不同應用場景給出合適的檢測器選擇建議，而非深入探討專業細節。
測量方法和直方圖
到達陽極的電荷云會產生一個電壓脈沖。更準確地說， 施加在高壓上的正電位會被到達的負電荷以脈沖形式略微衰減。此時的電荷是可測量的，但仍然非常微弱。因此，需要進行仔細的設計以確保獲得有意義的測量結果。基本上，有三種不同的測量概念，將在下文概述。這些概念適用于所有類型的檢測器，包括“雪崩光電二極管”和“混合探測器”章節中描述的雪崩光電二極管和混合探測器。然而，這些方法并非對所有檢測器都同樣適用。
我們在此也想探討一下評估方法，因為用戶與其說是對檢測器的工作原理感興趣，不如說是更關心這些信號對其測量和研究的意義。
電荷放大器
圖6：檢測器S在吸收一個光量子hν后產生電荷Q。該電荷由一個運算放大器進行累加。運算放大器（OP）確保其反相輸入端（–）的電壓始終等于同相輸入端（+）的電壓。因此，當來自PMT陽極的電荷到達時，會立即通過對電容器C充電來進行補償（紅色圓圈）。然后，電容器上的電荷對應于在整個測量時間內到達的電荷，輸出電壓Ua與C成正比，因此可以進行測量。在一個像素的測量結束后，系統會被重置為零。
測量PMT信號的傳統技術是使用所謂的電荷放大器。在掃描顯微鏡中，激發光束持續掃描樣品，每條掃描線都需要劃分為所需數量的像素。對于經典的結構圖像，典型的記錄時間約為一秒，每幅圖像包含1000條掃描線，每條線包含1000個像素。因此，每個像素的記錄時間約為1微秒。在這1微秒內，來自PMT的所有電荷都會在電容器中累積，如圖7所示。總時間的一部分會用于重置電荷放大器，以便其在下一個像素的測量時重新從零開始。最終得到一個與從PMT接收的總電荷成正比的電壓。然后，該電壓通過模數轉換器（ADC）轉換為“灰度值”。通常使用8位分辨率，即灰度值是介于0和255之間的整數。通過調節PMT的高壓，可以確保測得的信號“落入”這8位范圍內，即充分利用整個動態范圍，而不會因過載而導致信號截斷。
圖7：使用電荷放大器進行測量時，在一個像素的時間段內，電荷脈沖（藍色）和積分信號（紅色）的變化。亮度讀數是最終的積分值。然后在重置階段對電容器進行放電，以便開始下一個像素的測量。
顯然，這些灰度值并不代表絕對亮度值，而只能用于比較不同圖像區域的相對亮度，或者比較在相同測量設置下采集的圖像的亮度。如上所述，每個入射光子的信號強度變化很大。在一個圖像元素的亮度測量時間內，會有若干甚至許多光子入射。可能的取值是單個光子電荷的所有組合，這些組合本身就是準連續變化的。 因此，累積測量中的光子事件完全模糊，信號強度呈現連續分布。數字化過程則將這種連續分布轉換為256個離散的亮度值，即灰度值。
圖8：植物根莖切片的雙通道圖像。感興趣區域用黃線標出。大部分區域是黑色背景，在直方圖的左側區域，即低灰度值區域，表現為非常高的峰值。為了使實際信號的直方圖清晰可見，計數被限制為僅顯示非背景結果。紅色通道的信號是紅色直方圖中的肩部（介于80和200灰度值之間）。
當然，實驗人員通常并不關注單個圖像元素的亮度，而是 關注諸如完整細胞或組織成分等結構的強度。因此，他們會選擇一個感興趣區域（ROI）并獲取其亮度值。根據圖像分辨率（通常約為1000 x 1000像素，即1百萬像素），數百甚至數千個圖像元素會被組合成一個單一的數值。然后，可以將該平均值與其他結構的值進行比較，或者在活體材料實驗中將其繪制為時間變化曲線等。例如，還可以更精確地分析該區域內的亮度分布。為此，需要生成一個直方圖，統計具有特定亮度的圖像元素數量。由于有256種不同的亮度級別，因此在8位直方圖的x軸上會顯示從0到255的數字。由于數字化過程，這里不存在中間值。因此，嚴格來說，直方圖中不應存在連續的線條。此外，y軸上繪制的頻率也只能是整數，這很合理，因為它們代表圖像元素的數量。圖8展示了一個此類直方圖。我們可以從該直方圖中提取各種細節；這里我們主要關注三個屬性。
如果亮度分布是對稱的，則平均亮度值位于直方圖的最大值處。然而，我們經常會觀察到某種程度的不對稱性，表明平均值略微偏離最大值，可能偏左或偏右。
對于極端的亮度波動，曲線會變得非常“寬”。如果沒有方差，則只會有一個灰度值，“曲線”將無限窄。因此，寬度是方差的體現。然而，影響這種方差的因素不僅是每次測量時間內到達圖像元素的 photons 數量分布，還包括測量系統的噪聲特性，尤其是PMT以及電子設備的噪聲。只有當這些噪聲部分足夠小時，才有可能根據平均值與寬度的比率來估計 contributing photons 的數量。
由于零點由電子設備的設置固定，因此無法從灰度值直方圖中推斷出背景亮度中PMT暗電流的比例。
為了獲得可用的圖像，需要大約為3的信噪比（SNR）。當在圖像元素中記錄到10個光子時，即可達到此信噪比。對于線頻為1 kHz的1百萬像素圖像，這意味著每秒有1000萬個光子入射。然而，通常我們會盡量使用較弱的光照，因為高強度激發會破壞熒光染料，且產生的分解產物通常對生物體有害。 因此，需要降低激發強度，以在圖像質量和樣本穩定性之間取得平衡。因此，每個像素通常只記錄到平均1到3個甚至更少的光子。即使信號極其微弱，只要每個像素的平均光子數遠小于1，仍然可以進行有效的評估。
為什么即使只有10個光子，我們也能獲得遠超過200種不同的灰度值？15種不同的亮度級別難道不夠嗎？如果每個光子在圖像中產生相同的信號，那么15級就足夠了。但是，正如我們上面所述，脈沖高度變化很大（強度存在噪聲）。如果一個像素中累加了多個光子的脈沖，則可能的亮度值數量會再次增加。這就是亮度級別數量龐大的原因。而且，使用的級別越多（例如使用約12或16位的較低灰度分辨率），我們就越會放大脈沖變化產生的噪聲。然而，這樣做并不能提供更好的信息。
圖9：上圖：如果圖像中只使用了少量灰度級，則直方圖僅在狹窄的范圍內顯示數值。下圖：如果將這些灰度級乘以一個系數，以充分利用8位動態范圍（例如，為了使顯示器上的圖像更易于觀察），則灰度級的數量保持不變，中間的級別仍然為空，從而導致直方圖中出現“間隙”。
直方圖還提供其他有用的信息。如果在記錄過程中沒有充分利用0到255的完整動態范圍，而只使用了底部十分之一（0到25），則顯示器上的圖像會非常暗，因為顯示器只使用了0到25的灰度值。我們只能通過“擴展”直方圖來使圖像變亮，這是當今所有數碼相機都自動提供的常用技術。這種方法是將每個像素的亮度值乘以相同的系數Z。在上述情況下，我們需要將所有值乘以10，以覆蓋0到255的范圍。然而，由于最初只有25個不同的值，因此最終圖像中也只有25個不同的值。因此，直方圖會出現間隙；在我們的示例中，所有繪制的灰度值之間都缺少9個值。因此，圖表看起來有些“雜亂”，但數據是正確的。
雖然電荷放大器多年來一直用作共聚焦顯微鏡上測量PMT信號的設備，但它現在已基本被其他技術取代（見下文）。電荷放大器提供的信號是對整個像素時間內的信號進行積分，因此結果取決于像素時間的長度。然而，如果改變掃描格式（例如，在相同的掃描速度下，每行只記錄100個而不是1000個像素），則像素時間會發生變化。此時信號會增大10倍，因此需要調整PMT上的高壓。改變掃描速度也會產生相同的效果。此外，由于電荷放大器的復位需要一定的時間，因此每個像素的測量時間都會損失一部分。 在高掃描速度和高分辨率下，像素時間非常短，復位造成的損失會變得顯著。直接數字化可以解決這個問題。
直接數字化
圖10：與圖7中相同的光子事件。與高保真技術類似，PMT輸出端的信號以高頻率直接數字化（紅色星號）。數字化頻率（采樣時鐘）設置得足夠高，以高于測量系統的電子帶寬（“過采樣”），從而確保信號被完整捕獲。
現代數字化電路的速度足夠快，能夠直接將PMT信號轉換為數字量。具體方法是通過一個適當阻值的電阻對PMT產生的電荷進行放電，并以高時鐘頻率將由此產生的電壓轉換為灰度值。單個圖像元素的數據在記錄過程中會立即進行平均，因此，無論記錄一個圖像元素需要多長時間，圖像最終獲得的灰度值都能真實地反映樣本的強度。采用這種方法，無需重新調整PMT的高壓，可以直接比較亮度值。此外，也不存在因復位而造成的時間損失。
使用直接數字化方法獲得的直方圖與使用電荷放大器時獲得的直方圖看起來完全相同，并且基本上包含相同的信息。這是因為平均方法本質上也是對測量數據進行累加，只不過是立即在正確的時間軸上進行縮放。掃描變焦也不會改變圖像亮度，除非是由于不同程度的熒光染料漂白等原因造成的真實亮度變化——但這屬于有價值的信息，而不是測量偽影。漂白現象也可以通過這種方法立即進行量化。
這項技術的另一個優點是不存在因清空存儲器而造成的死時間。這使得在極短的像素時間內能夠獲得更好的信噪比。
光子計數
我們現在可以使用清晰簡潔的直方圖來描述強度。然而，有趣的是，世界遠非如此平滑和連續。正如馬克斯·普朗克[7]無意中發現的那樣，光并非以連續強度的形式存在。因此，我們的探測器測量的是單個事件——光子的到達，而不是連續的強度值。表面上的連續性是測量上的模糊性造成的：PMT模擬測量的直方圖顯示的是模糊測量的合并結果。正如我們已經提到的，PMT接收到的每個光子都會產生一個寬度變化的脈沖，其強度先上升后下降。通過對大量寬度和高度不同的脈沖進行積分或平均，可以獲得一個看似連續的亮度直方圖，其中可以出現任何強度值。此外，這些強度值的數量取決于數據記錄中人為設定的“灰度深度”。然而，事實并非如此。仔細考慮后會發現，像素中的亮度不能用有理數表示。它只能是一個整數，事實上，它只能是在該像素的測量時間內到達探測器的光子確切數量。因此，與其對每個脈沖的電荷（即脈沖曲線下的面積）進行積分或平均，不如直接計數到達陽極的電荷脈沖，而不評估脈沖大小。這將解決大部分噪聲問題。
* 事實上，光強也取決于光子的顏色，這會對脈沖高度產生輕微影響。然而，這種能量差異在整個光譜范圍內僅約為2電子伏特。與第一個倍增極上約80伏特的電壓相比，這可以忽略不計。對于下文將討論的混合探測器（HyD），這種變化甚至要小一百倍左右。
光電子的初始速度也存在類似情況，正如我們之前提到的，光電子可以從陰極向任何方向發射。一些光電子會朝著期望的方向運動，而另一些則需要通過改變方向來加速，這會導致它們撞擊倍增極時的動能有所損失。這種動能的變化范圍也在±2電子伏特左右。
圖11：與圖7和圖10中相同的光子事件。對單個光子產生的電荷脈沖進行計數稱為“光子計數”。雖然這項技術產生的噪聲遠低于電荷放大，但它只能應用于高度相似且不會相互重疊的脈沖。此外，較小的脈沖可能無法被識別。
如今，這種計數器在電子學中已成為標準配置。脈沖的高度或斜率用于激活一個觸發器，每次觸發計數器值加1。在一個像素的測量結束時，計數器會被重置為0（這個過程幾乎不耗時），然后重新開始計數。然而，這種方法的局限性在圖11中顯而易見：脈沖必須能夠被單獨分辨。如果第二個脈沖在第一個脈沖期間發生，則只會檢測到一個脈沖，導致后續測量的亮度值偏低。脈沖是否能夠分離取決于脈沖之間的時間間隔和脈沖寬度。較寬的脈沖只適用于較低的亮度，因為否則脈沖之間會過于接近，容易發生重疊。較窄的脈沖即使在高強度（即較短的脈沖間隔）下也能產生良好的計數結果。
典型的PMT輸出的脈沖寬度約為20納秒，可以有效區分。如果光子總是以相同的時間間隔到達，則計數率可高達每秒5000萬次（50 Mcps）。然而，由于光子的到達是隨機的，脈沖重疊的概率會大大增加，從而降低了最高計數率。這里所說的最高計數率是指，當超過該計數率時，實際觸發的光電子數量與測量到的脈沖數量之間的關系不再呈線性。誠然，這是一個取決于誤差容限的任意定義。如果允許的偏差僅為1%，則線性關系會在0.5 Mcps時結束；如果允許10%的偏差，則線性關系會在5 Mcps時結束。在日常實踐中，1%的精度通常難以達到，而10%則超過了容忍閾值。例如，可以將閾值設定為6%，從而在計數率略高于10 Mcps時獲得有效的測量結果。
如果我們暫時假設沒有亮度波動（例如，通過照射一個固定點，不進行掃描），則光子平均會均勻地到達探測器，但其到達是隨機的。在這種泊松過程中，光子之間的時間間隔可以用指數分布來描述。我們無需在此深入探討細節，只需說明此過程可以用精確的數學術語來描述。在一定程度上，我們可以利用它來計算由脈沖重疊引起的、導致線性偏差的誤差。然而，如果已知誤差，我們就可以使用測得的脈沖數反推實際到達的脈沖數。這種方法在未經校正時誤差變得顯著的脈沖率的五倍范圍內有效。因此，這種校正方法被稱為線性化。這是一種用于擴展測量范圍的、廣為人知且有充分描述的方法[7]。
圖 12：圖12：通過校正統計概率實現計數率的線性化。請注意對數x軸[6]。
與原始計數的脈沖（對應于光子）不同，這種線性化方法（類似于展寬）在計算中會產生小數以及整數。這反過來會影響直方圖，因為直方圖通常只繪制整數，例如灰度值。無論如何，這些能量通道的寬度通常總是恒定的，并且總是可以將任何小數轉換為整數，例如從0開始然后簡單地繼續計數。因此，線性化會導致直方圖中出現拍頻效應，從而使個別能量值遠超出直方圖的包絡線。雖然起初可能令人困惑，但這是對統計校正后的光子數的精確表示。
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參考文獻：[1] Becquerel AE: Mémoire sur les effets électriques produits sous l’influence des rayons solAIres. Comptes Rendus 9: 561–67 (1839).
[2] Hertz HR: Ueber den Einfluss des ultravioletten Lichtes auf die electrische Entladung. Annalen der Physik 267 (8): 983–1000 (1887).
[3] Hallwachs WLF: Ueber die Electrisierung von Metallplatten durch Bestrahlung mit electrischem Licht. Annalen der Physik 34: 731–34 (1888).
[4] Einstein A: Ueber einen die Erzeugung und Verwandlung des Lichtes betreffenden heuristischen Gesichtspunkt. Annalen der Physik 322 (6): 132–48 (1905).
[5] Newton I: Opticks. Or, A Treatise of the Reflections, Refractions, Inflections and Colours of Light (1704).
[6] Planck M: Ueber irreversible Strahlungsvorg?nge. Ann. Phys, 1: 69–122 (1900).
[7] Hamamatsu Photonics KK: Photomultiplier Tubes – Basics and Applications. Ed. 3a: 310 (2007).
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