應用指南 | 小鼠原代小腸類器官培養(yǎng)實驗
  #應用指南#

2009 年，Hans Clevers 及其團隊利用 Lgr5+ 腸干細胞在體外培養(yǎng)出了三維小腸類器官結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)反映了腸上皮細胞的生理狀況，可進行長期體外培養(yǎng)，同時保持細胞分化能力。這種方法越來越多地用于干細胞研究、疾病模型和再生醫(yī)學。

小腸類器官既可以用多能干細胞或胚胎干細胞培養(yǎng)，也可以用小腸隱窩干細胞培養(yǎng)。后者由于方便、技術簡單、可多次傳代，可進行長達兩個月的長期體外培養(yǎng)，因此更為常見。
 
本應用說明重點介紹了 GelNestTM 基質(zhì)膠在小鼠腸道原代組織類器官培養(yǎng)中的應用。  
材料與方法
  Part.01 原代小腸組織提取消化
1. 將小鼠安樂死。從回腸末端采集 15 厘米長的腸管。
2. 去除外膜，用冷的 PBS 沖洗。用剪刀剪開腸段，使腸腔朝上。用冰凍 PBS 輕輕清洗剪開的腸段。
3. 在 50 mL 離心管中加入 15 mL 冰冷 PBS。用剪刀將腸管剪成 1~2 mm 的小段，然后用 PBS 沖洗。重復清洗步驟，直至清澈為止。
4. 去除上清液，將組織碎片重懸于 25 mL 腸隱窩消化液（含 2-5mM EDTA）中，冰浴 20 分鐘，然后在 20 rpm 旋轉(zhuǎn)床上旋轉(zhuǎn) 30 分鐘。去除上清液。
5. 將組織碎片重懸于 10 mL 含有 10% FBS 的冷（2-8℃）PBS 緩沖溶液中。用 70 μm 過濾器過濾上清液，并將濾液裝入 50 mL 的干凈試管中。重復過濾 3 次，合并濾液。
6. 300×g 離心 5 分鐘。棄去上清液。
7. 將沉淀重懸于 10 mL PBS 緩沖溶液中。200×g 離心 3 分鐘。除去上清液。如果懸浮液中單細胞過多，請重復離心步驟。
 
Part.02 小腸隱窩計數(shù)篩選與接種
1. 取 10 μL 細胞樣本，在顯微鏡下計數(shù)隱窩。200×g 離心 3 分鐘，取出上清液。
注：適合培養(yǎng)的隱窩大小不一，通常呈長方形或圓形，邊緣相當光滑，看起來像上皮單層的小的折疊部分。絨毛、單細胞或碎屑濃度較高的部分不是類器官培養(yǎng)的理想選擇。目標是最大程度地富集合適的隱窩。
2. 將隱窩重懸在腸類器官完全培養(yǎng)基中，每微升培養(yǎng)基含 8-20 個隱窩。制作完全培養(yǎng)基時，加入：
3. 取 150 μL 隱窩懸浮液，與等體積未稀釋的 GelNestTM 類器官專用基質(zhì)膠（NEST 211272）混合，然后輕輕地用移液管上下移動十次，使其充分混合。
4. 將 50 μL 樣品加入預熱好的 24 孔板的每個孔的中心，形成圓頂狀結(jié)構(gòu)。避免形成氣泡。
5. 將平板置于 37℃，靜置 10 分鐘，使基質(zhì)凝膠凝固。小心處理平板，避免干擾凝膠。
6. 小心地向每個孔中加入 500 μL 室溫（15-25℃）類器官培養(yǎng)基，從側(cè)面倒入以避免擾動凝膠。
 
Part.03 類器官培養(yǎng)與觀察
1. 監(jiān)測類器官的生長。通常，在培養(yǎng) 3 小時左右，隱窩形成球形結(jié)構(gòu)。2-4 天后，類器官開始出芽，到第5-7 天形成復雜結(jié)構(gòu)。
2. 第二天完全更換培養(yǎng)基。小心去除孔邊緣的舊培養(yǎng)基，加入 500 μL 新鮮的室溫類器官培養(yǎng)基。
3. 定期在倒置顯微鏡下觀察腸類器官并記錄。
4. 選擇合適的抗體對類器官進行染色，并在熒光顯微鏡下觀察，同時包括適當?shù)奶禺愋詫φ铡?
5.使用NEST免費的類器官AI大模型分析軟件進行識別批量、無標記分析由顯微鏡獲取的類器官照片（不限顯微鏡品牌），幫助您更快、更準確的獲得類器官的數(shù)量、大小（面積）、圓度、周長、灰度值（可統(tǒng)計熒光照片的不同類器官/細胞球的熒光強度，或明場照片的類器官亮度，從而反應類器官的死活狀態(tài)）等參數(shù)，并生成統(tǒng)計分析結(jié)果。

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實驗結(jié)果分析

圖 1. 小鼠小腸類器官在 GelNestTM 基質(zhì)膠中的生長情況。
  在第 2 天在 10 倍物鏡下，可觀察到小型空泡狀結(jié)構(gòu)；在第 3 天可觀察到明顯變大的空泡結(jié)構(gòu)；在第 6 天可觀察到具有多個出芽結(jié)構(gòu)的小腸類器官，且培養(yǎng)皿里的類器官可肉眼直接觀察到白色顆粒狀細胞團。標尺為 200 微米。
圖 2. 早期小腸類器官的細胞骨架蛋白和細胞增殖抗原的免疫染色結(jié)果。  
可觀察到在 GelNestTM 基質(zhì)膠中生長的早期的小腸類器官為單細胞層形成的空泡結(jié)構(gòu)，并且將小腸類器官種在 100 倍稀釋的 GelNestTM 基質(zhì)膠包被的平皿里，細胞仍然保持有較好的增殖能力（ki67 陽性）。

DAPI 為細胞染料核（藍色）；alpha-Tubulin 為細胞骨架蛋白（紅色）；ki67 為表達于細胞核中的細胞增殖活性的標志物。標尺為 150 微米。
圖 3. 小腸類器官的緊密連接蛋白和上皮細胞特征蛋白的免疫染色結(jié)果。  
可觀察到在 GelNestTM 基質(zhì)膠中（3D）或者在基質(zhì)膠薄層上（2D）生長的小腸類器官均能很好的保持生物功能性細胞標志物的表達。

DAPI 為細胞染料核（藍色）；ZO-1 為細胞緊密連接蛋白標志物（綠色）；CK19 為上皮細胞特征標志物。標尺為 100微米。
圖 4.在 GelNestTM 基質(zhì)膠中生長 6 天的小腸類器官的緊密連接蛋白和上皮細胞特征蛋白的免疫染色結(jié)果。  
可觀察到在 GelNestTM 基質(zhì)膠中（3D）生長的小腸類器官能很好的保持生物功能性細胞標志物的表達。

DAPI 為細胞染料核（藍色）；ZO-1 為細胞緊密連接蛋白標志物（綠色）；CK19 為上皮細胞特征標志物。標尺為100 微米。
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