文章來源公眾號：華人抗體 作者：小藥說藥 引言
幾十年來，抗體偶聯(lián)藥物（ADC）和生物偶聯(lián)物的進(jìn)步徹底改變了各種疾病的靶向治療。與傳統(tǒng)的化療不同，ADC選擇性地靶向腫瘤細(xì)胞，同時(shí)保留正常細(xì)胞，使其非常適合癌癥治療。目前，全球市場上已有17種ADC獲得不同國家監(jiān)管機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)。臨床試驗(yàn)中有超過200多個(gè)ADC正在探索，預(yù)計(jì)未來幾年還有更多ADC商業(yè)化，使癌癥患者受益。 ADC設(shè)計(jì)中的多種因素影響其成功，包括抗體、接頭、有效載荷選擇、藥物附著位點(diǎn)和藥物抗體比（DAR），所有這些因素都起著重要作用。藥物附著在抗體上的方法至關(guān)重要；藥物連接的位置和方式會(huì)影響ADC的穩(wěn)定性、療效和藥代動(dòng)力學(xué)（PK）。



偶聯(lián)方法傳統(tǒng)上分為兩類：隨機(jī)偶聯(lián)和位點(diǎn)特異性偶聯(lián)。進(jìn)一步，可以將這些技術(shù)分為三類。第一類是隨機(jī)偶聯(lián)（例如隨機(jī)賴氨酸）。第二類是位點(diǎn)特異性的，但不是位點(diǎn)選擇性的，因?yàn)檫@些位點(diǎn)受到所使用的偶聯(lián)技術(shù)的限制。這一類別包括酶、聚糖、親和肽偶聯(lián)和“隨機(jī)”鏈間半胱氨酸偶聯(lián)。第三類是位點(diǎn)特異性和位點(diǎn)選擇性，修飾氨基酸序列，如工程半胱氨酸或非天然氨基酸，提供各種結(jié)合位點(diǎn)。關(guān)于CMC，隨機(jī)偶聯(lián)和鏈間半胱氨酸偶聯(lián)通常更簡單。位點(diǎn)特異性和位點(diǎn)選擇性偶聯(lián)技術(shù)提供了更好的同質(zhì)性，但可能會(huì)遇到更多的CMC挑戰(zhàn)，包括蛋白質(zhì)表達(dá)問題（如非天然氨基酸）、去除雜質(zhì)所需的額外純化步驟（如酶）以及額外的分析和質(zhì)量控制挑戰(zhàn)（如DAR分布）。 一、隨機(jī)偶聯(lián) 賴氨酸偶聯(lián)是一種成熟的生產(chǎn)ADC的技術(shù)，利用賴氨酸殘基上約40個(gè)溶劑可及的NH2基團(tuán)，這些基團(tuán)在中性溶液中具有高度的親核性。親電試劑主要針對這些氨基，允許接頭有效載荷附著而不改變抗體本身。迄今為止，五種市售ADC證明了賴氨酸偶聯(lián)的功效。受到這一成功的鼓舞，已經(jīng)開發(fā)了一系列更廣泛的連接子，包括N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）及其類似物、苯甲酰氟、異硫氰酸酯和方酸甲酯。 然而，由于這些連接子與雜原子具有高度反應(yīng)性，因此它們也可以在水中淬滅。事實(shí)上，NHS酯的水解是影響賴氨酸偶聯(lián)中l(wèi)inker-payload（LP）當(dāng)量的關(guān)鍵因素之一。此外，反應(yīng)性較低的連接子可以在溫和的條件下與半胱氨酸的-SH殘基反應(yīng)，在這種條件下，與賴氨酸的反應(yīng)很慢。 總的來說，賴氨酸偶聯(lián)仍然是生產(chǎn)ADC的可靠方法，可以產(chǎn)生化學(xué)穩(wěn)定和可重復(fù)的產(chǎn)品。此外，位點(diǎn)特異性結(jié)合技術(shù)的發(fā)展繼續(xù)增強(qiáng)了其更好的同質(zhì)性的潛力。 二、位點(diǎn)特異性但非位點(diǎn)選擇性偶聯(lián) 鏈間半胱氨酸偶聯(lián)
通常，IgG1抗體在溶劑暴露區(qū)域含有四對鏈間二硫鍵。使用還原劑如三（2-羧乙基）膦（TCEP）和DL-二硫蘇糖醇（DTT）還原后，可以獲得八種游離硫醇。與賴氨酸殘基上的SN2反應(yīng)相比，硫醇作為親核試劑更柔軟，更容易發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)。這種特性允許馬來酰亞胺及其類似物用作連接子，從而能夠形成清潔且?guī)缀醵康膸€基丁二酰亞胺。這種生物正交化學(xué)非常適合抗體修飾，產(chǎn)生具有0、2、4、6和8個(gè)有效載荷的變體。 由于巰基較少，半胱氨酸介導(dǎo)的ADC異質(zhì)性遠(yuǎn)低于賴氨酸方法。與其他偶聯(lián)方法相比，馬來酰亞胺偶聯(lián)物因其簡單、可控條件和高產(chǎn)率而脫穎而出。迄今為止，馬來酰亞胺與減少的鏈間二硫化物結(jié)合仍然是ADC構(gòu)建的主要方法。在15個(gè)具有強(qiáng)效毒性有效載荷的商業(yè)化ADC中，有10個(gè)以及大多數(shù)處于臨床階段的ADC都使用了馬來酰亞胺偶聯(lián)技術(shù)。



馬來酰亞胺-硫醇偶聯(lián)物易于逆轉(zhuǎn)邁克爾加成反應(yīng)，導(dǎo)致通過血清蛋白相互作用過早釋放有效載荷。這種逆邁克爾加成反應(yīng)會(huì)影響ADC在血漿中的穩(wěn)定性，降低其有效性和安全性。為了解決這個(gè)問題，科學(xué)家們探索了幾種策略，包括通過引入額外的基團(tuán)如N-芳基和鄰氨基來催化馬來酰亞胺的水解，或者用開環(huán)馬來酰亞胺甲酯代替馬來酰亞胺，以避免逆邁克爾加成反應(yīng)。此外，新型連接體如KTHIOL?、P5?和溴乙酰氨基癸酰基已顯示出增強(qiáng)的硫醇選擇性和對逆邁克爾加成反應(yīng)的抗性。 酶標(biāo)簽偶聯(lián)
酶偶聯(lián)涉及通過利用識(shí)別特定氨基酸序列的酶將有效載荷直接附著到抗體上。該技術(shù)在ADC中提供了高均一性，展示了其作為有效偶聯(lián)方法的潛力。許多酶需要序列工程和抗體等底物的結(jié)構(gòu)適應(yīng)性。臨床上使用的酶包括Sortase A（SrtA），這是一種30 kDa的轉(zhuǎn)肽酶，可以切割LPXTG序列形成硫酯酰基酶中間體，使肽LPXT轉(zhuǎn)移到底物的N端。值得注意的例子包括NBE-002（SMAC Technology?），目前處于1/2期試驗(yàn)階段。 另一個(gè)是甲酰甘氨酸生成酶，它附著在CXPXR序列上，將半胱氨酸轉(zhuǎn)化為甲酰甘氨酸，使用這種偶聯(lián)方法的ADC如TRPH-222（SMARtag?），目前處于1期臨床階段。法尼烷基轉(zhuǎn)移酶通過在CaaX標(biāo)簽內(nèi)的半胱氨酸殘基上添加類異戊二烯基團(tuán)來修飾抗體，這類的ADC如FS-1502（ConjuAll?）目前處于III期臨床階段。還有一些酶，如微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（mTG），靶向抗體上的天然位點(diǎn)，如Q295位點(diǎn)，催化谷氨酰胺的γ-羧酰胺與有效載荷的游離胺基之間形成酰胺鍵，代表性分子如DP303，目前處于III期臨床。此外，一些處于臨床前研究階段的ADC使用的酶包括肽天冬酰胺基連接酶、微管蛋白酪氨酸連接酶、胰蛋白酶、磷酸泛乙烯基轉(zhuǎn)移酶、SpyLigase和O6烷基胍DNA烷基轉(zhuǎn)移酶。 酶偶聯(lián)過程通常比傳統(tǒng)技術(shù)更復(fù)雜，需要更廣泛的材料和更復(fù)雜的步驟，這會(huì)顯著影響生產(chǎn)成本和成功的可能性。此外，與傳統(tǒng)的偶聯(lián)相比，酶偶聯(lián)引入了額外的成分，如結(jié)合酶、輔因子和表達(dá)相關(guān)雜質(zhì)，所有這些都具有潛在的免疫原性。需要采取額外的措施來消除最終產(chǎn)品中的催化酶和污染物。總的來說，酶偶聯(lián)是一種強(qiáng)大的位點(diǎn)特異性技術(shù)，在臨床前和臨床階段取得了許多成功。下一代酶偶聯(lián)技術(shù)可以通過技術(shù)更新和優(yōu)化CMC工藝來提高產(chǎn)品的均一性。 聚糖重塑偶聯(lián)
近十年來，糖偶聯(lián)引起了學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的極大興趣。雖然大多數(shù)乙二醇偶聯(lián)方法仍然依賴于酶來促進(jìn)偶聯(lián)過程，但它們不需要氨基酸序列工程。早期的技術(shù)涉及使用高碘酸鈉（NAIO4）氧化聚糖上的順式二醇，為隨后的修飾創(chuàng)造醛基。最近的策略強(qiáng)調(diào)聚糖重塑，其中天然聚糖（附著在N297位點(diǎn)）被修飾或替換為新的聚糖，然后可以與功能性連接子或連接子-載荷復(fù)合物連接。
Synaffix的GlycoConnect?技術(shù)使用內(nèi)切糖苷酶來修剪天然聚糖異構(gòu)體，然后添加疊氮修飾的半乳糖殘基和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。然后，這種修飾的聚糖通過帶有兼容手柄的點(diǎn)擊化學(xué)與有效載荷偶聯(lián)。這種方法在ADC開發(fā)中得到了廣泛的應(yīng)用，有六個(gè)活躍的臨床階段項(xiàng)目使用了這種方法，包括IBI-343。然而，這個(gè)過程涉及至少兩種酶和三個(gè)偶聯(lián)步驟，這可能會(huì)使開發(fā)復(fù)雜化，降低產(chǎn)量，并增加CMC成本。 此外，從化膿性鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)糖苷酶EndoS和EndoS2，這些酶能夠水解IgG的N-聚糖，從而使水解后的殘基成為生物偶聯(lián)的有效位點(diǎn)，使靶分子能夠在一個(gè)偶聯(lián)步驟中附著到N297位點(diǎn)。這種方法有助于使單抗的聚糖結(jié)構(gòu)均勻化，同時(shí)它也適用于任何IgG亞型。盡管尚未經(jīng)過臨床驗(yàn)證，但endo-S2方法因其降低的CMC成本而極具吸引力。 親和肽偶聯(lián)
親和定向偶聯(lián)使用來自蛋白A或G IgG結(jié)合位點(diǎn)的親和肽。該肽選擇性結(jié)合Fc區(qū)的特定位點(diǎn)，使其更接近某些賴氨酸殘基，并提高連接子和-NH2基團(tuán)之間的反應(yīng)速度。為了防止與其他反應(yīng)性-NH2基團(tuán)發(fā)生副反應(yīng)，應(yīng)使用溫和的連接子。典型的結(jié)合位點(diǎn)位于Fc區(qū)的K248/K288或K337殘基附近；雖然親和肽的序列修飾可以將結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到Fab區(qū)，但這通常會(huì)導(dǎo)致結(jié)合效率降低。一些開創(chuàng)性的方法涉及用穩(wěn)定的共價(jià)鍵將連接子偶聯(lián)到親和肽上，然后共價(jià)連接到抗體上形成ADC。然而，大型非天然肽可能通過阻礙FcRn結(jié)合來干擾Fc功能，從而可能減少ADC內(nèi)化。 三、位點(diǎn)特異性和位點(diǎn)選擇性偶聯(lián) 工程化半胱氨酸隨機(jī)半胱氨酸偶聯(lián)和重橋接是利用抗體結(jié)構(gòu)內(nèi)天然存在的半胱氨酸殘基的技術(shù)。與它們不同的是，硫單抗技術(shù)通過利用不涉及結(jié)構(gòu)二硫鍵的工程化反應(yīng)性半胱氨酸，在抗體上實(shí)現(xiàn)所需位點(diǎn)的選擇性和均勻修飾。一般來說，半胱氨酸突變的設(shè)計(jì)是為了促進(jìn)細(xì)胞毒性有效載荷偶聯(lián)的同時(shí)，保持單克隆抗體的穩(wěn)定性、親和力和最小化ADC聚集。為了確定突變的最佳位置，通常采用幾種技術(shù)，包括計(jì)算建模、模型系統(tǒng)篩選和高通量掃描。 Junutula等人首先報(bào)道了一種硫單抗策略，用工程化半胱氨酸殘基取代了抗MUC16抗體重鏈114位的丙氨酸（HC-A114C），工程化位置內(nèi)的反應(yīng)性硫醇能夠與馬來酰亞胺負(fù)載的連接子反應(yīng)。合成的抗MUC16 ADC在異種移植小鼠模型中表現(xiàn)出效力，在大鼠和食蟹猴中表現(xiàn)出高劑量耐受性，這個(gè)發(fā)現(xiàn)建立了硫單抗偶聯(lián)策略的一般性方法。 下表詳細(xì)列出了臨床階段ADC中使用的工程化半胱氨酸位點(diǎn)。


非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸
除了硫單抗技術(shù)外，非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（ncAA）的加入為位點(diǎn)特異性偶聯(lián)提供了另一種可能性。該技術(shù)使用含有獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)的氨基酸，從而能夠以化學(xué)選擇性的方式引入連接子-有效載荷復(fù)合物。該技術(shù)需要對抗體序列重組，利用與宿主細(xì)胞內(nèi)所有內(nèi)源性tRNAs和合成酶正交的tRNA和氨基酰tRNA合成酶（aaRS），用于響應(yīng)未賦值密碼子將ncAA帶入蛋白質(zhì)。通常，ncAA在發(fā)酵過程中被添加到培養(yǎng)基中。選擇非天然氨基酸是很重要的，因?yàn)樗鼈兛赡芗ぐl(fā)免疫原性。常用的ncAA是具有獨(dú)特基團(tuán)的天然氨基酸的類似物，如酮、疊氮、環(huán)丙烯或二烯。 已有研究將對乙酰苯丙氨酸（pAcF）成功地整合入抗CXCR4 抗體中。有效載荷Auristin通過肟連接與抗體有效偶聯(lián)，從而生成化學(xué)均一的ADC。該ADC在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出良好的體外活性和完全清除肺腫瘤的作用。 由于肟連接所需的酸性條件和ADC緩慢釋放的動(dòng)力學(xué)，另一種選擇是加入含ncAA的疊氮化物。廣泛應(yīng)用的對疊氮哌苯胺（pAzF）可在生理條件下快速進(jìn)行CuAAC或SPAAC反應(yīng)，利用這種策略成功地在抗CD74抗體上偶聯(lián)糖皮質(zhì)激素有效載荷。除了pAcF技術(shù)外，還成功地將含疊氮的賴氨酸類似物（AzK）帶入到抗體中，以產(chǎn)生具有Auristin、PBD二聚體或微管蛋白有效載荷的位點(diǎn)特異性ADC。 此外，賴氨酸的環(huán)丙烯衍生物（CypK）以及自然發(fā)生的非典型氨基酸，如硒代半胱氨酸（Sec）都成功地整合進(jìn)入抗體中。所產(chǎn)生的ADC表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性、選擇性以及體外和體內(nèi)活性。 結(jié)語 由于偶聯(lián)技術(shù)對ADC特性的廣泛影響，確定特定抗體/連接子-有效載荷組合的最佳偶聯(lián)位點(diǎn)和化學(xué)物質(zhì)仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。這些影響包括結(jié)合、內(nèi)化、有效載荷釋放、PK、效應(yīng)器功能等。盡管一些新興的偶聯(lián)技術(shù)通常表現(xiàn)出更好的療效和安全性，但臨床前和臨床研究之間的轉(zhuǎn)化經(jīng)常存在差距。此外，即使整個(gè)過程看起來更簡單，新的偶聯(lián)技術(shù)也會(huì)在CMC過程中帶來意想不到的挑戰(zhàn)。隨著我們對ADC復(fù)雜性的理解加深，以及我們從更多采用先進(jìn)偶聯(lián)方法的ADC中積累臨床數(shù)據(jù)，預(yù)計(jì)將出現(xiàn)新的、更合適的偶聯(lián)技術(shù)。這些技術(shù)進(jìn)步將進(jìn)一步解決未滿足的臨床需求。