細(xì)胞有幾個(gè)核？？？
并非所有細(xì)胞都只有1個(gè)細(xì)胞核喔~    破骨細(xì)胞：高度分化的多核細(xì)胞，無克隆能力，無法傳代培養(yǎng)，且破骨細(xì)胞體外培養(yǎng)較為困難......

Section.01
骨代謝: 背景知識

老樣子，在開始本期內(nèi)容前，先來點(diǎn)背景知識做“開胃小菜”！ 當(dāng)然，做骨骼相關(guān)研究的小伙伴兒們可自行略過~

首先，我們來了解下有關(guān)骨代謝的專業(yè)術(shù)語！

骨重塑

骨重塑：指的是破骨細(xì)胞清除舊骨或受損骨質(zhì)，并由成骨細(xì)胞形成的新骨取代的過程。

骨骼，是一種動(dòng)態(tài)組織。其在人的整個(gè)生命過程中是不斷被重塑的。持續(xù)重塑是維持骨骼關(guān)鍵功能所必需的，它能防止骨損傷的積累，并維持骨骼的機(jī)械強(qiáng)度和鈣穩(wěn)態(tài)^[1]。

骨重塑過程由破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的“交流”來調(diào)控完成^[2]。

• 破骨細(xì)胞 (osteoclasts，OCs)：是一種骨吸收細(xì)胞，源自造血干細(xì)胞，它通過分泌酸性酶和蛋白水解酶來降解骨質(zhì)。
• 成骨細(xì)胞 (Osteoblasts，OBs)：是一種骨形成細(xì)胞，它由間充質(zhì)前體細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄因子的連續(xù)作用下分化為骨祖細(xì)胞譜系而產(chǎn)生，并最終分化為骨細(xì)胞。

圖 1. 破骨細(xì)胞生成和成骨細(xì)胞生成的策略 ^[1] 。

骨礦化

骨礦化： 指的就是鈣的沉淀過程。 鈣、磷等無機(jī)鹽沉淀在骨頭組織的過程，就叫骨的礦化。

簡單說，礦化是進(jìn)化過程中的一種被動(dòng)選擇。

生物礦化的起源可以追溯到前寒武紀(jì)晚期，當(dāng)時(shí)構(gòu)造活動(dòng)導(dǎo)致海水中可溶性礦物顯著增加。人們普遍認(rèn)為，海洋生物首先發(fā)展出由碳酸鈣和/或磷酸鈣礦物組成的原始外骨骼，漸漸地，骨骼組織被內(nèi)化。礦化骨骼強(qiáng)大的承重能力使得大型脊椎動(dòng)物得以進(jìn)化 ^[3] 。

作為一種特殊的結(jié)締組織， 骨骼具有高度礦化的結(jié)構(gòu)和構(gòu)造 。一方面，作為內(nèi)部支撐系統(tǒng)，骨骼可為身體提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，并為運(yùn)動(dòng)提供肌肉附著點(diǎn)。同時(shí)，骨骼還保護(hù)大腦和內(nèi)臟器官，并為骨髓造血組織提供場所。此外，骨骼也是無機(jī)離子 (尤其是磷酸鹽和鈣) 的主要來源和儲存地，它們能夠積極參與體內(nèi)礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)和能量代謝^[4]。

骨吸收

骨吸收： 指的是骨鈣溶出的過程。 也就是把鈣從骨頭里面“搬”出來。破骨細(xì)胞將硬骨組織分解為礦物質(zhì)，同時(shí)將骨骼中的鈣釋放至血液中。

破骨細(xì)胞是唯一明確可降解骨的細(xì)胞，在骨穩(wěn)態(tài)和健康維持中至關(guān)重要。

破骨細(xì)胞是一種組織特異性的多核巨噬細(xì)胞，由血液及骨髓中的單核/巨噬細(xì)胞系分化而來  (圖 2) 。其分化過程經(jīng)歷破骨細(xì)胞前體  (osteoclast precursor cells，OPCs，或稱 preosteoclasts) 、融合的多核破骨細(xì)胞  (non-functional polykaryons) 、成熟破骨細(xì)胞  (mature osteoclasts，也稱極化的多核破骨細(xì)胞)  等幾個(gè)階段。
 


圖 2. 破骨細(xì)胞分化過程圖 ^[5] 。
下面顯示了阻斷破骨細(xì)胞生成和活化的單基因突變。斜體字表示在嚙齒動(dòng)物和人類中自然發(fā)生的突變，而其他則是通過靶向誘變產(chǎn)生無效等位基因的結(jié)果。上面顯示的是增加破骨細(xì)胞生成和/或活化及存活并導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的單基因突變等位基因。請注意，除了 OPG22 和 sRANKL77 轉(zhuǎn)基因小鼠過表達(dá)模型（藍(lán)色邊框）外，所有這些突變均為無效突變。

如圖 2 所示，M-CSF（CSF-1）和 RANKL 對破骨細(xì)胞生成至關(guān)重要，二者缺一不可。 OPG  可以結(jié)合并中和 RANKL，從而負(fù)向調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成和成熟破骨細(xì)胞的活化。

? RANKL ：核因子 κB 受體活化因子配體 (Receptor Activator for Nuclear Factor-κBLigand，RANKL) 被認(rèn)為是促進(jìn)破骨細(xì)胞最為分化成熟及其功能活性最重要的因子，由成骨細(xì)胞/間充質(zhì)干細(xì)胞分泌，結(jié)合破骨細(xì)胞前體膜上的 RANK 受體，激活下游 NF-κB、MAPK、NFATc1 通路。

? M-CSF ：巨噬細(xì)胞集落刺激因子，可誘導(dǎo) RANK 在破骨細(xì)胞前體的細(xì)胞膜上表達(dá)，進(jìn)而使表達(dá) RANK 的破骨前體細(xì)胞和 RANKL 結(jié)合并產(chǎn)生效應(yīng)，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。

目前，已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)破骨細(xì)胞形成和功能失調(diào)與骨質(zhì)疏松癥、骨折愈合、骨關(guān)節(jié)炎和原發(fā)性/轉(zhuǎn) 移性 骨腫瘤等密切相關(guān)^[2]。體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化對研究骨代謝疾病、藥物篩選具有重要作用。

Section.02
破骨細(xì)胞的體外誘導(dǎo)

目前破骨細(xì)胞主要采用的是骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)法   (bone marrow monocytes，BMMs)  和 RAW264.7 細(xì)胞系誘導(dǎo)法兩種方法。

方案一、小鼠骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)方案

1. 骨髓細(xì)胞提取

(1)  取 6-8 周齡小鼠，使用 CO ₂  吸入致死。用 75% 酒精消毒小鼠毛皮。
(2) 取雙側(cè)股骨、脛骨，用無菌注射器吸取無菌  PBS  沖洗骨髓腔 3 次，收集液體于 15 mL 離心管中，300×g 4℃ 離心 5 min，棄上清。
(注：避免用力過猛導(dǎo)致細(xì)胞機(jī)械損傷)
(3)  過 70 -100 μm 細(xì)胞篩，1500 rpm 離心 5 min。室溫下紅細(xì)胞裂解液 處理 5 min，PBS 洗滌 2 次。
 
圖 3. 骨髓細(xì)胞提取示意圖 ^[6] 。

2. BMMs 貼壁篩選

(1)  用 5 mL 含 10% FBS  的 α-MEM 培養(yǎng)基重懸，離心，棄上清。
(2)  用 5 mL 含 M-CSF  (25 ng/mL)  和 10% FBS 的 α-MEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。接種于 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中  (每只小鼠一孔) ，置于 37°C、5% CO ₂  細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。
(3)  收集上清離心，棄上清液  (主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞) ，用 5 mL 含有 50 ng/mL M-CSF 的完全培養(yǎng)基重懸后，以 5×10 ⁴  cells/孔的密度接種于 24 孔板中  (每孔 1 mL) ，2-3 天后貼壁細(xì)胞即為骨髓來源巨噬細(xì)胞；

3. 破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化

(1)  棄上清液，用無菌 PBS 清洗 2 次。使用含有 50 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL 的完全培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化；
(2)  細(xì)胞每 3 天換一次液，并補(bǔ)加因子 25 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL，4-6 天后進(jìn)行誘導(dǎo)鑒定。

不同孔板建議加入的細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)液體積
 

 
MCE 客戶驗(yàn)證
 
圖 4.兩種多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基 和 M-CSF (HY-P7085, 20 ng/L) 誘導(dǎo)正常小鼠原代巨噬細(xì)胞破骨形成 ^[7] 。
用 MM 細(xì)胞、CM 和 M-CSF (20 ng/L) 處理原代小鼠巨噬細(xì)胞，然后進(jìn)行 TRAP 染色。含有三個(gè)以上細(xì)胞核且 TRAP 呈陽性的細(xì)胞被視為破骨細(xì)胞。

方案二、巨噬細(xì)胞系 RAW264.7 誘導(dǎo)破骨細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)方案

(1)  用含 10% FBS 的 α-MEM 培養(yǎng)基將 RAW264.7 細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以 3×10⁴ cells/孔的密度接種于 24 孔板中。
(2)  細(xì)胞接種 12 h 后，加入 RANKL  (20-100 ng/mL) 。每 3 天更換培養(yǎng)基，并同時(shí)補(bǔ)加 RANKL  (20-100 ng/mL) 。
(3)  較為明顯的多核破骨細(xì)胞將在分化培養(yǎng) 4 天后開始出現(xiàn)，并在第 5 天至第 6 天逐漸變得豐富。

RAW 264.7 細(xì)胞表達(dá) M-CSF 及其受體 c-fms。因此，僅加入 RANKL 就足以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，無需額外加入 M-CSF。

MCE 客戶驗(yàn)證
 
圖 5. RANKL (HY-P7425, 35 ng/mL) 誘導(dǎo) 5 天后，Raw 264.7 發(fā)生破骨細(xì)胞分化 ^{[8 ]} 。
TRAP 染色視野和定量分析結(jié)果顯示，與對照組相比，RANKL 處理導(dǎo)致 Raw 264.7 多核破骨細(xì)胞數(shù)量顯著增加 (p < 0.01)。

Section.03
破骨細(xì)胞，如何鑒定？

一、形態(tài)學(xué)鑒定

1. 多核巨細(xì)胞

相差顯微鏡下可見 ≥3 個(gè)細(xì)胞核  (成熟破骨細(xì)胞通常含 10–20 個(gè)核) 。

2. 偽足結(jié)構(gòu)

活化破骨細(xì)胞邊緣呈“皺褶緣”  (ruffled border) ，為骨吸收功能區(qū)域。鬼筆環(huán)肽染色后共聚焦顯微鏡觀察  (特征性"封箱帶"結(jié)構(gòu))
 
圖 6.鬼筆環(huán)肽對破骨細(xì)胞中的足狀體肌動(dòng)蛋白帶進(jìn)行染色 ^[9] 。 
M-CSF (30 ng/mL) 和 RANKL (100 ng/mL) 誘導(dǎo) BMMs 破骨分化。當(dāng)破骨細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)，用 PBS 輕輕沖洗，用 0.1%  Triton X-100  滲透 30 min，最后用羅丹明偶聯(lián)的  Phalloidin  染色，檢測細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)的形成，同時(shí)細(xì)胞核用  DAPI  復(fù)染。

二、功能標(biāo)志物檢測

1. Trap 染色

破骨細(xì)胞產(chǎn)生許多酶，其中主要是抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartrate-resistant acidic phosphatase, Trap)， Trap 特異地分布于破骨細(xì)胞中，為破骨細(xì)胞所特有，通常作為鑒別破骨細(xì)胞的重要標(biāo)志物。

【實(shí)操步驟】

• 細(xì)胞樣本 (以 48 孔板為例)：

(1)  移除細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入 400 μL PBS 清洗，棄液。
(2) 每孔加入 300 μL 4%  多聚甲醛溶液 ，室溫固定 15-30 min，棄液。
(3)  每孔加入 300 μL PBS，清洗 2 次。
(4)  染色：每孔加入 150-200 μL TRAP 染色液，37℃ 避光孵育 10-15 min  (待測樣品中酒石酸酸性磷酸酶活性較低時(shí)，可適當(dāng)延長孵育時(shí)間至 30 分鐘或顯微鏡下顯色至預(yù)期深淺) 。
(5)  每孔加入 300 μL PBS，清洗 2 次。
(6)  顯微鏡下觀察和拍照。

2. 骨吸收實(shí)驗(yàn)

骨髓單核細(xì)胞  (BMMs) 接種于羥基磷灰石涂層板或骨片，觀察吸收陷窩的情況。

例如，為了檢測體外破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響，將 BMMs 接種于磷酸鈣涂層仿骨骨分析 Stripwell 板。培養(yǎng)期間，每天補(bǔ)充一次含有 M-CSF、RANKL 的新鮮培養(yǎng)基。10 天后，用超聲波去除骨片表面細(xì)胞，用 SEM  (掃描電子顯微鏡)  對吸收凹陷進(jìn)行成像，并使用 I mageJ 軟件對凹陷面積進(jìn)行量化。用茜素紅染色液對磷酸鈣涂層仿骨骨分析 Stripwell 板進(jìn)行染色，并使用共聚焦激光顯微鏡進(jìn)行拍照，三維重建，觀察骨片中的凹坑 ^[5] 。
 
圖 7. 高鋅環(huán)境下的老年骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (BMSCs) 外泌體能夠抑制破骨細(xì)胞分化和骨質(zhì)破壞 ^[9] 。
(A-B) 不同同牛骨切片上骨吸收凹坑及其吸收區(qū)域的代表性掃描電子顯微鏡圖像和（C）切片上 3D 重建的共聚焦顯微鏡觀察。(Con:正常的 BMMs 破骨誘導(dǎo)組; Aged-EXO:不含鋅的老化外泌體處理組; Aged + Zn ²⁺ -EXO:添加鋅的老化外泌體處理組)

三、分子標(biāo)志物檢測

qPCR/WB 檢測  Trap 、 NFATc1 、 CTSK   (組織蛋白酶 K) 、DC-STAMP (細(xì)胞融合相關(guān)蛋白)。

qPCR/WB 技術(shù)實(shí)操不在贅述，需要的小伙伴可參考往期推文： 從基礎(chǔ)到進(jìn)階：PCR、qPCR 和 RT-PCR 不是一回事兒？(內(nèi)含 Protocol) ； 干貨分享 | WB 常見問題及解決方案  

實(shí)驗(yàn)小提示

(1) RAW264.7 細(xì)胞在含有 10% FBS 的  RPMI-1640  或  DEME  培養(yǎng)基中可以增殖并保持其分化為破骨細(xì)胞的能力，而其在含有 10% FBS 的 α-MEM 中培養(yǎng)可進(jìn)行破骨細(xì)胞分化試驗(yàn)。
(2)  RAW264.7 分化為破骨細(xì)胞的成功與否與細(xì)胞狀態(tài)密切相關(guān)，建議使用 15 代以內(nèi)的 RAW264.7 細(xì)胞。
(3)  分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基工作液建議現(xiàn)配現(xiàn)用，使用前注意 37 ℃ 溫育。
(4)  使用的 RANKL 和 M-CSF 濃度可能因小鼠和實(shí)驗(yàn)室條件而異。
(5)  破骨細(xì)胞形成初期，細(xì)胞呈紡錘形，成熟后，細(xì)胞變大，多核，呈圓形。從 RANKL 和 M-CSF 添加后的第 4 天起，每天至少觀察一次細(xì)胞，因?yàn)樾∈笃乒羌?xì)胞在完全分化后非常不穩(wěn)定。
(6)  誘導(dǎo)成功后立即進(jìn)行染色，小鼠破骨細(xì)胞在成熟后 24 h 內(nèi)死亡。
 

產(chǎn)品推薦

RANKL/TNFSF11 Protein, Mouse (HY-P7425) RANKL 是 RANK 的激活劑。當(dāng)與 RANK 結(jié)合后，其誘導(dǎo)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，并進(jìn)一步導(dǎo)致破骨細(xì)胞前體成熟。

M-CSF Protein, Mouse (HY-P7085) M-CSF 是調(diào)節(jié)造血前體細(xì)胞（特別是單核吞噬細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞）存活、增殖和分化的關(guān)鍵協(xié)調(diào)因子。

TNFRSF11B/OPG Protein, Mouse (HEK293, His) (HY-P71017) 競爭性抑制 RANKL-RANK 結(jié)合，負(fù)調(diào)控破骨細(xì)胞生成。

Red Blood Cell Lysis Buffer (HY-3010) 即用型溶液，能快速、有效的從人或鼠等的血液或組織樣品中裂解并去除無核紅細(xì)胞，不影響白細(xì)胞、正常組織或腫瘤細(xì)胞。

DMEM (High Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, no HEPES) (HY-K3001) 廣泛使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

Rhodamine Phalloidin (HY-K0903) 羅丹明偶聯(lián)的 Phalloidin，檢測細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)的形成。

TRAP Antibody (YA2321) (HY-P82576) 適用于 Human, Mouse, Rat 的 WB, IHC-P, ICC/IF, IP。

NFAT2 Antibody (HY-P80243) 適用于 Human 的 WB, IHC-P, FC。

 

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