引言

以人類或動物細胞、組織及體液等生物材料為起始原料生產的生物制品，在其制備流程及制劑階段，可能會引入人或動物源的原材料及輔助物質。這些起始原料、添加的原材料以及所使用的輔料，均存在遭受病毒污染的潛在威脅。

為了有效控制生物制品受病毒污染的風險，國內外監管機構均出臺相關法規，強制要求生物制品的生產流程必須包含能夠有效滅活或去除病毒的工藝步驟，以此來確保最終產品的生物安全性。

生物制品病毒污染的歷史案例

病毒污染是構成治療用生物制品安全性的重大威脅之一。歷史上，由于缺乏對病毒污染風險的充分認知，加之病毒檢測技術與病毒滅活/去除手段存在局限性，血源性生物制品以及通過工程細胞與工程細菌表達生產的生物制品在生產流程中曾遭遇嚴重病毒污染事件。Table 1列舉了部分歷史上生物制品遭受病毒污染的典型案例。

Table 1. 歷史上生物制品病毒污染案例

  相關法規概覽

隨著對生物制品病毒安全控制要求的不斷提升，基于各國藥品監管機構與業界長期積累的豐富經驗，一系列針對生物制品病毒安全控制與評估的法規和技術規范相繼出臺。以下是本文在撰寫過程中主要參考的相關法規：

1）生物組織提取制品和真核細胞表達制品的病毒安全性評價的技術審評一般原則，藥品評審中心，2005

2）血液制品去除/滅活病毒技術方法及驗證指導原則，NMPA，2002

3）《中國藥典》三部，生物制品通則-生物制品病毒安全性控制，2020

4）ICH Q5A（R1）：來源于人或動物細胞系的生物技術產品的病毒安全性評價，ICH，1999

5）Technical Report No.83-Virus Contamination in Biomanufacturing: Risk Mitigation, Preparedness, and Response. PDA. 2019

6）Guidance for Industry -Process Validation: General Principles and Practices. FDA. 2011

  病毒安全性評價范圍

根據《中國藥典》2020年版三部通則的最新要求，生物制品在病毒安全性控制方面需特別關注以下幾類，并采取相應的預防措施：

1）人血液制品：由于原料血漿直接來源于人體，因此感染病毒的風險較高。對此類制品，需重點加強人血漿來源的病毒風險控制，并確保生產工藝具備高效的病毒清除能力。具體而言，凝血因子產品需實施兩步原理不同的病毒去除/滅活步驟，如S/D法和納濾；免疫球蛋白產品則推薦采用低pH孵育和納濾等兩步不同的病毒去除/滅活方法；而白蛋白產品，其下游純化采用的低溫乙醇生產工藝已具備一定的病毒滅活效果，結合巴氏消毒法可進一步確保病毒安全性。必要時，還需對上市產品進行病毒安全性的追溯。

2）重組治療性生物制品：此類制品需重點關注工程細胞基質、工程菌、原材料及輔料的病毒污染來源控制，同時確保生產工藝具備強大的病毒清除能力。

3）動物體液/組織來源制品：對于此類制品，應重點考慮起始原材料中動物病毒，尤其是人畜共患病毒的風險控制，并確保生產工藝能有效清除病毒。在必要時，還需對產品進行病毒污染的檢測，以確保其安全性。

上游病毒污染來源檢測

生物制品的上游污染來源分為內源性和外源性病毒污染兩類。內源性病毒污染源包括工程細胞。工程細胞可能源于人的組織或器官、動物的組織或器官、植物的組織或其他來源。這些工程細胞一旦污染病毒，可能會帶入到下游工藝，成為病毒污染的源頭。對于外源性污染源，主要包括物流控制、人員控制、設施環境和過程監測。

以工程細胞來源生物制品為例，確保細胞庫無污染是生物制品生產的重中之重。監管機構對細胞庫的污染檢測有明確嚴格的要求。細胞庫鑒定要求人和哺乳動物細胞系從主細胞庫（MCB）、工作細胞庫（WCB）到生產終末細胞（EOPC/CAL）的全面的細胞庫檢定。對于未處理收獲液批次放行，要求每個生產批次收獲的細胞/未經處理的細胞收獲液（UPB）均需進行外源病毒和支原體的檢測。其他來源生物制品的病毒污染來源分析和風險控制可以此為參考。

病毒清除定義及實施時間

在GLP實驗室環境中，通過應用縮小模型，有目的的將一定量的模型病毒添加（即“加標”）至未加工的收獲液或各生產步驟的中間體中。這一做法旨在定量評估滅活/去除病毒工藝步驟的有效性，具體通過測量病毒在工藝過程中的下降水平來實現，并據此確定工藝所能降低的病毒總體水平，以確保產品的安全性。

病毒滅活/去除工藝是保障生物藥品安全性的核心環節。根據監管機構的嚴格規定，生物制品的生產流程必須包含能有效滅活/去除病毒的工藝步驟。在提交IND/BLA申請時，必須提供詳盡的病毒清除研究報告。而在產品上市之后，根據實際需求或生產工藝的任何變更，還需對工藝步驟的有效性進行再次驗證（Fig.1）。

Fig.1 病毒清除驗證時間

指示病毒的選擇

指導原則中明確規定，一個典型的驗證研究所選病毒應全面覆蓋多種類型。具體要求包括：至少應包含單鏈和雙鏈的RNA及DNA病毒、脂包膜和非脂包膜病毒、強弱抵抗力病毒以及大小顆粒病毒。

綜合相關法規要求，模型病毒的選擇應遵循以下六項原則：

1）需同時包含脂包膜病毒與非脂包膜病毒；

2）要涵蓋DNA病毒與RNA病毒；

3）要包括大顆粒病毒與小顆粒病毒；

4）應選擇與潛在污染風險相同或相近的病毒；

5）要考慮對所選滅活/去除方法具有較強抗性的病毒；

6）優先選擇對實驗人員安全的替代指示病毒。

法規還進一步要求，所選指示病毒應盡可能對人類無致病力，與潛在污染病毒相似且易于體外培養，同時需適合具體產品特性及工藝特點，并對驗證工藝具有耐受性。

根據這些要求，用于病毒清除研究的模型病毒可分為三類：相關病毒（如血液制品相關的人類病毒）、特異模型病毒（如CHO表達系統的MuLV和MVM病毒）以及非特異模型病毒（如CHO表達系統的PRV和Reo3病毒）。在實際操作中，應優先選擇與潛在污染病毒密切相關的病毒，以確保驗證研究的有效性和可靠性。

Table 2、Table 3、Table 4分別列出了CHO表達生物制品、桿狀病毒/SF9表達系及血液制品中常用的模型病毒及主要特性。

Table 2. CHO表達系中可選用的模型病毒

Table 3. 桿狀病毒/SF9表達系中可選用的模型病毒

Table 4. 血液制品中可選用的模型病毒

病毒清除工藝的有效性評估

法規中關于病毒滅活/去除有效性評估的內容明確指出了一系列標準，用以衡量工藝步驟的病毒清除效果。

具體而言，若驗證研究中的工藝步驟能夠使指示病毒數量被去除/滅活達到4個LRV（Log Reduction Value，對數減少值）或以上，則該步驟的病毒滅活/去除效果被視為有效。對于去除/滅活效果在1至4個LRV之間的工藝步驟，其病毒滅活/去除效果被認定為一般有效。然而，當工藝步驟的去除/滅活效果小于1個LRV時，其病毒滅活/去除效果則被視為不顯著。值得注意的是，這些不顯著的工藝步驟在評估總體工藝病毒滅活/去除效果時，其LRV數值將不計入總體工藝的病毒滅活/去除LRV總數之中，否則可能會對清除病毒的實際能力估計過高。這些規定為病毒滅活/去除工藝的有效性和可靠性提供了明確的評估標準。

病毒滅活/去除工藝

在病毒清除工藝的選擇與具體設計方面，我們需遵循一系列嚴格的原則和要求。首先，選擇工藝時需確保至少包含一步有效的非包膜病毒清除步驟，這是保障病毒清除效果的基礎。同時，工藝中還需至少包含兩種從機制上能互補且有效的工藝步驟，以增強病毒清除的全面性和可靠性。

在具體設計工藝方案時，我們需進一步細化各項要求。首先，雙申報去除/滅活病毒的驗證研究必須符合GLP（Good Laboratory Practice，良好實驗室規范）的要求，以確保研究的科學性和嚴謹性。其次，我們需要研究影響去除/滅活病毒效果的各項參數，包括機械參數和理化參數，并確定這些參數允許變化的幅度，通常通過驗證最劣條件來確保工藝的穩定性和適應性。

此外，病毒滅活動力學的研究也是不可或缺的，這包括病毒滅活速率和滅活曲線的分析，有助于我們更深入地了解病毒滅活的動態過程。同時，為了更準確地評估病毒清除效果，指示病毒的滴度應盡可能高，以模擬最壞情況下的病毒負載。最后，在加入病毒進行驗證時，病毒與待驗證樣品的體積比需控制在一定范圍內，一般不超過1∶9，以避免因病毒濃度過高或過低而影響驗證結果的準確性。

綜上所述，通過遵循這些原則和要求，我們可以設計出更加科學、有效且可靠的病毒清除工藝。常用的病毒滅活/去除工藝如Table 5所示。

Table 5. 病毒滅活/去除工藝

巴氏消毒法

巴氏消毒法是在60℃條件下對蛋白質溶液進行連續加熱至少10h，其原理是長時間高溫使病毒蛋白變性從而抑制病毒遺傳物質的復制，最終使病毒失去傳染性。巴氏滅菌法對包膜病毒和非包膜病毒均有效果，是白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白、蛋白酶抑制劑等血液制品常用的病毒滅活方法。

干熱法

采用80℃加熱72h的處理方法可以滅活HBV、HCV、HIV和HAV等病毒。應該考慮制品的水分含量、制品組成（如：蛋白質、糖、鹽和氨基酸）對病毒滅活效果的影響，應確定允許的制品瓶間各參數的差異，同時病毒滅活用的干熱箱至少每半年驗證一次。干熱法適用于凍干制劑、凝血因子制品。

有機溶劑/去污劑(S/D, Solvent/Detergent) 法

利用有機溶劑和非離子表面活性劑的混合物能夠破壞脂包膜病毒的類脂膜。通常選擇磷酸三丁脂 (TNBP) 和非離子化的去污劑（Triton X-100或PS80）組合。S/D法主要用于凝血因子制品、蛋白酶抑制劑、人免疫球蛋白等血液制品的脂包膜病毒滅活。因為S/D法引入有機溶劑，所以需要在后續工藝中去除加入的S/D試劑。

如Fig.2所示，使用mAb1和mAb2收獲的細胞培養液(HCCF)進行實驗，以評估溫度和Triton X-100濃度對MuLV滅活的影響。對于這兩種單抗，在12℃時的滅活速度比20℃慢，這表明較低的溫度和較短的時間是最差的情況，A和B圖對比表明0.3%和0.5%Triton X-100對MuLV的滅活效果無差異。

Fig.2 Genentech研究溫度(A)、時間(B) 和Triton X-100濃度對X-MuLV滅活的影響

低pH滅活法

低pH滅活法針對包膜病毒而且要求樣品在低pH條件下性質穩定。低pH滅活法是重組或者雜交的動物真核細胞經培養后表達、分泌的生物制品和直接采用動物組織原材料經提取、純化制備的治療用生物制品常用滅活方法。從病毒滅活效果的角度看：pH越低、孵育溫度越高、孵育時間越長或者樣品濃度越低，則滅活效果越好。

納濾膜過濾法

納濾膜過濾法是當前最可靠的病毒清除技術，主要基于尺寸排阻，利用病毒和蛋白大小的不同，小于平均孔徑的蛋白通過濾膜，大于平均孔徑的病毒截留在膜內，對各類病毒（包膜病毒和非包膜病毒）達到有效清除。使用20nm左右的濾膜對生物制品溶液進行過濾，去除指數通常可以達到4LRV以上，且不影響產品質量，有效且穩健。

色譜層析法

利用病毒和目標產品在與層析介質接觸時親和力或其他相互作用方面的差別，實現各種組分的分離。層析方法包括親和層析、陰或陽離子交換、復合模式層析等，Table 6列舉了這幾種層析方法去除病毒的能力。

層析技術去除病毒，需要考慮層析技術類型和層析填料使用次數（新、舊填料）對于去除病毒效果的差別，一般情況下，新舊填料的病毒清除能力沒有顯著差異。

Table 6. 層析技術病毒清除結果

  國內外申報差異
  臨床試驗申請（IND）階段

藥品申報新藥研究申請 (Investigational New Drug, IND) 階段的要求主要體現在模型病毒的選擇、工藝選擇和工藝重復性3個方面。Table 7列舉了國內外血液制品和抗體/重組蛋白制品在IND申報階段的要求。

Table 7. 國內外IND申報病毒滅活/去除驗證要求

注：血制品中模型病毒選擇時，水皰性口炎病毒（VSV）耐受的pH范圍比較廣，驗證低pH孵育法滅活病毒效果時可選用此指示病毒。

生物制品許可申請（BLA）階段

藥品申報生物制品許可申請 (Biologics License Application, BLA) 階段的要求主要體現在指示病毒的選擇、工藝選擇和工藝重復性3個方面，同時要求更加嚴格。Table 8列舉國內外血液制品和抗體/重組蛋白制品在BLA申報階段的要求。

Table 8. 國內外BLA申報病毒滅活/去除驗證要求

工藝參數要求

由于在生產規模上進行病毒清除驗證研究是不現實的，驗證只能按照生產工藝的縮小規模進行。縮小模型在關鍵參數及控制條件方面應與實際生產工藝嚴格保持一致。對于層析工藝，親和層析和陰離子層析表現出有效的病毒清除能力，因此這兩個層析步驟也常用于病毒清除驗證實驗。Table 9列舉了親和層析和陰離子層析（流穿模式）除病毒驗證中的最差工藝條件。

Table 9. 工藝參數要求

檢測方法

在評估病毒清除效果時，細胞毒性和病毒干擾性是兩個必須考慮的關鍵因素，因為它們會嚴重干擾病毒滴度的準確測定。因此，在工藝中間品中加入病毒以研究其清除效果之前，首要任務是對這些中間品進行深入的細胞毒性和病毒干擾性研究，以確保準確評估樣品中的實際病毒滴度。此外，在病毒滅活/去除的工藝驗證環節中，對病毒檢測方法的靈敏度、特異性、穩定性和重復性均提出了高要求。
在病毒滅活/去除的工藝驗證中，病毒的檢測方法要求高靈敏度、高特異性以及很好的穩定性和重復性。目前的病毒檢測方法主要為噬斑檢測法（定量）、細胞病變法（半定量）、核酸定量（定量檢測）。

? 噬斑檢測法(PFU 法)：適用于去除和滅活工藝。 

? 細胞病變(TCID50 法)：適用于去除和滅活工藝。 

? 核酸定量(qPCR 法)：適用于去除工藝；不適用于滅活工藝。

  每劑量病毒顆粒估算

對于起始數目可以估算的病毒，如模型逆轉錄病毒，Fig.3提供了如何計算安全系數的例子。這種計算的基本目的是找出單個病毒顆粒進入單劑量產品的概率，下游病毒滅活/去除工藝4~6個對數的過量清除基本上意味著10^4~10^6個劑量中只有一個劑量可以含有病毒顆粒。

Fig.3 計算模型逆轉錄病毒的安全系數的例子

總結

為了有效控制生物制品的病毒安全性風險，我們必須高度重視起始原材料的污染風險及其檢測，同時密切關注生產工藝過程中病毒的清除能力。依據相關法規，我們應制定科學合理的病毒滅活/去除驗證工藝以及檢測方法，以便準確評估工藝的有效性。此外，在生物制品的整個生命周期內，我們都需要持續進行病毒污染風險的控制與檢測，從而最大限度地降低生物制品的病毒污染風險，確保產品的安全性。

 

參考文獻

[1] NMPA：生物組織提取制品和真核細胞表達制品的病毒安全性評價的技術審評一般原則，2005.12

[2] NMPA：血液制品去除/滅活病毒技術方法及驗證指導原則，2002.05

[3] ICH. Q5A: Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of human or animal origin. 1999

[4]《中國藥典》三部2020年版：生物制品通則-生物制品病毒安全性控制

[5] Technical Report No. 83. Virus Contamination in Biomanufacturing: Risk Mitigation, Preparedness, and Response. PDA. 2019

[6] FDA：Guidance for Industry -Process Validation: General Principles and Practices. 2011

[7] Cytiva學堂：生物制品病毒滅活/去除驗證研究

[8] 國家藥典委員會：治療用生物制品病毒污染風險控制要點，2021

[9] George Miesegaes.(2014)Viral Clearance by Traditional Operations With Significant Knowledge Gaps (Session II): Cation Exchange Chromatography (CEX) and Detergent Inactivation. PDA 

[10] Shukla, A. Aranha, H. (2015) Viral clearance for biopharmaceutical downstream processes. Pharmaceutical Bioprocessing.